口服降糖藥致低血糖對糖尿病大鼠神經生長因子mRNA表達的影響*

唐明薇，黎 瑤，王風波

(成都醫學院第一附屬醫院內分泌科,成都 610500)

論著·基礎研究

口服降糖藥致低血糖對糖尿病大鼠神經生長因子mRNA表達的影響*

唐明薇，黎 瑤，王風波△

(成都醫學院第一附屬醫院內分泌科,成都 610500)

目的 觀察糖尿病大鼠腦組織神經生長因子(NGF) mRNA表達變化及口服降糖藥致低血糖的影響作用。方法 64只Wistar大鼠分為對照組(16只)、糖尿病模型組(48只)，制備高脂高糖飲食+腹腔注射鏈脲佐菌素致2型糖尿病大鼠模型，模型組分為非藥物組(16只)、口服藥物治療組(16只)和低血糖組(16只)，口服藥物治療組和低血糖組大鼠均予格列本脲+二甲雙胍灌胃給藥，低血糖組劑量為口服藥物治療組5倍，每天1次，連續12 d，各組大鼠分別于低血糖反應第3、6、9、12天取腦組織行RT-PCR法NGF mRNA檢測。結果 與對照組相比，糖尿病模型組3組大鼠腦組織NGF mRNA表達均不同程度下降，低血糖降低最為顯著(P<0.01)，與非藥物組比較，口服藥物治療組升高明顯(P<0.01)，低血糖組則進一步降低(P<0.01)。結論 口服降糖藥可有效增強糖尿病大鼠腦組織NGF mRNA表達，而口降糖藥致低血糖能使NGF mRNA表達進一步下降，不利于糖尿病神經病變的修復。

低血糖癥；糖尿病；神經生長因子；口服降糖藥

據統計，糖尿病患病率在世界范圍內呈急劇上升趨勢，現今我國成年人的糖尿病患病率約為9.7%，成人糖尿病總數已超過9 240萬，已成為世界上糖尿病患病人數最多的國家，其中2型糖尿病占90.0%以上。我國糖尿病患病率急劇增加的原因可能與城市化、老齡化、生活方式改變等因素相關[1]。糖尿病周圍神經病變(DPN)是糖尿病最常見并發癥之一，在2型糖尿病患者中發病率超過60.0%，是糖尿病患者致殘的重要因素，嚴重影響著糖尿病患者身心健康。目前，DPN的發病機制尚未完全闡明，有研究證實神經生長因子(nerve growth factor，NGF) 及其受體的改變與缺失在其中起著重要作用，有效地控制血糖則有利于NGF的表達。糖尿病患者的治療過程中經常發生低血糖反應，低血糖給患者帶來的危害遠較高血糖更快、更嚴重，輕者即可致神經功能損害，對DPN的恢復顯然是很不利的。本研究通過口服常用降糖藥致糖尿病大鼠反復低血糖反應，觀察大鼠腦組織NGF mRNA的表達變化情況，旨在進一步探討低血糖對糖尿病神經系統病變臨床治療的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取64只Wistar成年雄性大鼠，體質量260～300 g，均由成都大學動物實驗中心提供；鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)；Trizol、DEPC(美國Gibco公司)；RT-PCR試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；引物合成(上海博亞生物技術有限公司提供)；格列本脲片(天津藥物研究院藥業公司)；鹽酸二甲雙胍片(齊魯藥業)；血糖儀及試紙條(羅氏)。

1.2 方法

1.2.1 分組及糖尿病造模 64只健康Wistar大鼠標準飼料適應性飼養7 d，室溫24 ℃左右，7 d后分為對照組(n=16)、糖尿病模型組(n=48)，糖尿病模型組又分為非藥物組(n=16)、

表1 各組大鼠血糖監測情況比較

△：P<0.01，與對照組比較；*：P<0.01，與非藥物組比較；#：P<0.01，與口服藥物治療組比較。

表2 各組大鼠腦組織RT-PCR法NGF mRNA檢測情況比較

△：P<0.01，與對照組比較；*：P<0.01，與非藥物組比較；#：P<0.01，與口服藥物治療組比較；○：P<0.05，◇：P<0.01，與3 d比較。

口服藥物治療組(n=16)和低血糖組(n=16)。參照張玉領等[2]建立糖尿病大鼠模型：糖尿病模型組大鼠給予高脂高糖飼料(其中15.0%豬油，15.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽)，高脂高糖飼料喂養1個月后，造模前禁食12 h，予腹腔注射25 mg/kg鏈脲佐菌素，注射前用0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋，對照組大鼠腹腔注射等劑量0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射72 h后取尾靜脈血測血糖，隨機血糖大于16.7 mmol/L為糖尿病模型建立成功。對照組大鼠飼普通飼料常規飼養。

1.2.2 口服給藥方法 糖尿病造模成功后第4天開始給藥，口服藥物治療組和低血糖組大鼠均給予格列本脲片+鹽酸二甲雙胍片溶于生理鹽水灌胃?？诜幬镏委熃M按成人劑量給藥，即格列本脲片50 μg/kg，鹽酸二甲雙胍片5 mg/kg，每天2次，低血糖組劑量為口服藥物治療組5倍，每天1次，連續12 d。對照組及非藥物組大鼠灌胃同劑量生理鹽水。低血糖反應標準：肢體抽搐，反應遲鈍或昏迷，血糖小于或等于2.8 mmol/L。20 min后灌胃10%葡萄糖1 mL，低血糖癥狀緩解。各組大鼠給藥期間均普通飼料喂養，分別于給藥后第3、6、9、12天各取4只腦組織，斷頭取腦時間設定為低血糖反應20 min左右，取腦大鼠不予灌胃葡萄糖。

1.2.3 腦組織RT-PCR法NGF mRNA檢測 Trizol法提取大鼠腦組織總RNA，核酸紫外分光光度計檢測RNA樣品A260/A280在1.8～2.0。RT-PCR法：逆轉錄為cDNA，PCR反應體系50 μL，PCR反應條件為94 ℃預變性5 min、94 ℃變性55 s、57 ℃退火45 s、72 ℃延伸50 s，35個循環后72 ℃終末延伸8 min；NGF上游引物序列:5′-GAT CGG CGT ACA GGC AGA AC-3′，下游引物序列:5′-GGC TCG CCA CTT GGT CTC GA-3′；β-actin上游引物序列:5′-GGT GAA GGT GGG TGG CAA-3′，下游引物序列:5′-TTC CCA TTC TCA GCC TTA AC-3′。將PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統分析。

2 結 果

2.1 一般情況比較 糖尿病造模成功后，大鼠在第2～3天逐漸出現不同程度的食量、飲水增加，尿量增多，消瘦，精神不振，體毛缺乏光澤，活動遲緩?？诜幬镏委熃M大鼠上述癥狀隨治療進程明顯改善，而低血糖組大鼠低血糖發作時肢體抽搐，反應遲鈍明顯甚至昏迷，血糖顯著下降，灌胃葡萄糖水后緩解，但精神狀態更差，活動減少。低血糖反應后20 min各組大鼠血糖監測情況，見表1。

2.2 4組大鼠腦組織RT-PCR法NGF mRNA檢測情況 與對照組相比，糖尿病模型組3組大鼠腦組織NGF mRNA表達均不同程度下降，低血糖組降低最為顯著(P<0.01)。與非藥物組比較，口服藥物治療組明顯升高(P<0.01)，低血糖組則進一步降低(P<0.01)；不同時間窗比較，非藥物組12 d較3 d有一定下降，差異有統計學意義(P<0.05)，低血糖組12 d明顯低于3 d，差異有統計學意義(P<0.01)，對照組、口服藥物治療組各時間點差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

3 討 論

盡管DPN在2型糖尿病患者中發病率很高，嚴重影響著糖尿病患者的身心健康，但目前DPN的發病機制仍然未能完全闡明。NGF又稱神經誘向因子，作為神經營養因子家族中的主要成員之一，具有使神經細胞存活率升高和促神經突觸生長的生物活性，與特異性受體TrkA相結合發揮生物學功效，促進受損神經細胞修復，延緩神經細胞的凋亡過程，在神經元的生長發育和神經軸突的再生修復中均扮演著重要角色，目前已在阿爾茨海默病及新生兒缺血、缺氧性腦損傷等中樞神經系統疾病的治療應用上得到了大量而肯定的研究成果[3]。NGF及其受體的異常在DPN的過程中亦起著重要作用，NGF合成障礙，逆向軸漿運輸能力降低及受體TrkA表達異常等均可影響神經損傷后再生修復，參與DPN的發生、發展[4]。近年來大量研究表明，有效控制血糖有利于增加NGF的表達，促進DPN恢復。有研究發現，2型糖尿病大鼠下頜下腺NGF陽性表達明顯降低，連續皮下注射胰島素治療2個月后糖尿病大鼠血糖得到顯著控制，下頜下腺NGF陽性反應明顯增強，接近或達到正常水平[5]。王蕾等[6]用降糖通絡湯灌胃2型糖尿病大鼠，免疫組織化學法檢測到大鼠坐骨神經組織中NGF表達呈漸行增高趨勢，與血糖控制水平呈正相關，且施萬細胞凋亡率明顯降低。呂翠巖等[7]用糖痹康灌胃2型糖尿病大鼠，大鼠坐骨神經組織中NGF水平與NGF mRNA表達顯著升高，呈強陽性表達，遠優于單純甲鈷胺片營養神經組對NGF表達的提升作用。有學者研究糖尿病大鼠周圍神經病變的超微結構變化，發現糖尿病大鼠腰骶部神經髓鞘水腫變性甚至脫落，神經細胞胞質及膠質空泡變性，同時腹腔內注射胰島素和鼠NGF治療后，大鼠膀胱逼尿肌細胞和腰骶部神經元中NGF的表達均明顯增強，神經變性明顯改善，優于單純胰島素或鼠神經生長因子治療組[8]。以上研究均說明，無論中藥或西藥，只要能夠有效控制血糖，均能增強神經組織NGF的表達，促進神經病變的再生修復。

低血糖是糖尿病臨床治療過程當中常見的不良反應，許多糖尿病患者由于缺乏對合理規范服用降糖藥物的良好認識，常有低血糖的發生，甚至頻繁的低血糖反應發作亦不鮮見。低血糖給患者帶來的危害遠較高血糖更快更嚴重，輕者即可致神經功能損害，對包括DPN在內的神經系統損傷恢復是極其不利的。反復重度低血糖對糖尿病大鼠海馬PKA磷酸化水平發生明顯增高改變，提示可致腦損傷和認知功能障礙，甚至神經元的喪失[9]。有研究用胰島素誘導大鼠低血糖后在海馬區免疫組織化學法檢測Nogo-A，發現低血糖組大鼠海馬區Nogo-A表達明顯降低，而低血糖后葡萄糖再灌注大鼠Nogo-A表達進一步降低，且細胞凋亡最多，提示低血糖不僅導致中樞神經損傷，而且低血糖后葡萄糖再灌注可加劇這種損傷，對于臨床常用的補糖糾正低血糖的方法提出了一定警示作用[10]。格列本脲片及鹽酸二甲雙胍片均有較強的降低血糖作用，雖然格列本脲片不良反應比較大，但是由于價格便宜，在我國廣大區域仍是臨床常用的口服降糖藥物，有報道服用格列本脲片可致較高的低血糖發生率，其中低血糖昏迷高達62.7%，服用格列本脲片的人群以老年人居多，往往合并心腦血管等各種慢性病，腎功能減退，長期混合服用多種藥物，更易導致嚴重的低血糖反應，持久且難以糾正[11]。本實驗采用格列本脲片+鹽酸二甲雙胍片超劑量灌胃2型糖尿病大鼠致反復低血糖發作，觀察到低血糖組大鼠較未降糖治療糖尿病大鼠腦組織NGF mRNA的表達更低，并隨著時間呈逐漸加重趨勢，雖然未降糖治療糖尿病大鼠的表達也呈逐漸降低表現，但低血糖組是更加明顯，說明低血糖嚴重妨礙了NGF的合成及表達，尤其頻繁反復發作的低血糖影響作用更甚，非常不利于糖尿病性神經病變的再生修復，為臨床上口服降糖藥治療糖尿病過程中的低血糖危害性的認識提供了進一步的理論依據。

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Effect of oral antidiabetic drugs on NGF mRNA expression in rats brain with diabetes*

TangMingwei,LiYao,WangFengbo△

(DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu,Sichuan610500,China)

Objective To observe the expression of NGF mRNA in rats brain with diabetes and the effects of hypoglycemia caused by oral antidiabetic drugs on NGF mRNA.Methods A total of 64 adult Wistar rats were randomly divided into control group(16)and diabetes model group(48).Using high fat and high sugar diet+intraperitoneal injection of streptozotocin to prepare type 2 diabetes model.The diabetes model group was randomly divided into non-medication group(16),oral medication group(16) and hypoglycemia group(16).The oral medication rats and hypoglycemia rats were given glibenclamide+metformin by intragastric administration once daily for 12 d,the dose of hypoglycemia rats was 5 times of treatment rats.The brain tissues of rats in each group were used respectively the RT-PCR method to detect NGF mRNA at 3,6,9 and 12 d.Results Compared with the control group,the expression of NGF mRNA in the brain tissues of the 3 groups of diabetic rats were decreased in different degrees and the non-medication group was the most obvious(P<0.01).Compared with the non-medication group,the oral medication group was significantly increased(P<0.01)，the hypoglycemia group was further decreased(P<0.01).Conclusion Oral hypoglycemic drugs can effectively enhance the expression of NGF mRNA in brain tissue of diabetic rats,but hypoglycemia caused by Oral antidiabetic drugs can make the expression of NGF mRNA further decreased.So hypoglycemia is not conducive to the repair of diabetic neuropathy.

hypoglycemia;diabetes mellitus;nerve growth factor;oral hypoglycemic drugs

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.08.004

四川省衛生廳科研課題(120478)。 作者簡介：唐明薇(1982-)，主治醫師，碩士，主要從事內分泌與代謝疾病診療工作?！?/p>

，E-mail:251205687@qq.com。

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1671-8348(2017)08-1017-03

2016-07-20

2016-09-18)