NFAT5基因報告載體的構建及其與miR-155關系的實驗研究*

舒 彬，李文婷，劉 真，張亞潔，尹 斌，趙 盼，張同威，賈赤宇△

(1.河北北方學院研究生部，河北張家口 075000；2.解放軍第三○九醫院燒傷整形科，北京 100091)

·論 著·

NFAT5基因報告載體的構建及其與miR-155關系的實驗研究*

舒 彬1，李文婷2，劉 真2，張亞潔2，尹 斌2，趙 盼1，張同威2，賈赤宇2△

(1.河北北方學院研究生部，河北張家口 075000；2.解放軍第三○九醫院燒傷整形科，北京 100091)

目的 通過生物信息軟件預測出miR-155的靶基因，構建miR-155靶基因熒光素酶基因報告載體，驗證其與miR-155的對應關系。方法 以數據庫 miR Base為依據，對miR-155進行生物信息學分析，通過Target Scan、Mir Base、Pic Tar三大軟件預測miR-155的靶基因；將設計合成的T淋巴細胞核因子5(NFAT5)及其突變序列NFAT5-mu序列分別克隆至熒光素酶報告質粒pMIR-REPORTTMLuciferace；將第4代人胚胎腎293AD(HEK-293AD)細胞按隨機數字表法分為4組：miR-155 mimics+pMIR-NFAT5組、miR-155 mimics+pMIR-NFAT5-mu組、miR-155 inhibitor+pMIR-NFAT5組、miR155 Negative control+pMIR-NFAT5組與對照質粒(pRL-TK)共轉染24 h后用雙熒光素酶檢測試劑盒測定相對熒光素酶活性。結果 Mirbase、TargetScan、PicTar預測交叉結果顯示，NFAT5基因3′UTR與miR-155存在結合互補位點；構建pMIR-NFAT5、pMIR-NFAT5-mu重組質粒經酶切及測序鑒定正確；雙熒光素酶報告基因檢測系統顯示：pMIR-NFAT5+miR155 mimics組較pMIR-NFAT5+miR-control 組熒光素酶活性降低,差異有統計學意義(P<0.01);而其他組間差異無統計學意義(P>0.05)。結論 成功構建pMIR-NFAT5、pMIR-NFAT5-mu熒光素酶報告基因重組質粒；證實miR-155對NFAT5基因mRNA 3′-UTR具有靶向調控作用,為下一步研究miR-155在吸入性肺損傷機制中的作用提供前期實驗室數據和方法。

T淋巴細胞核因子5；miR-155；熒光素酶基因報告載體

急性吸入性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)是指心源性以外的各種肺內、外致病因素(創傷，休克，嚴重感染，吸入有毒氣體，某些藥物中毒)引起的急性、進行性、缺氧性呼吸衰竭。據統計，燒傷患者合并吸入性損傷約占5%～10%，重度吸入性損傷的病死率高達80%，是燒傷早期主要死亡原因之一[1-2]。其發病機制主要是炎癥因子驟然增加，所致的失控炎癥反應有關[3-4]。核因子κB(NF-κB)信號轉導通路的激活和大量的巨噬細胞的浸潤在ALI/ARDS的病理生物學過程中有著重要作用[5-6]。微RNA(miRNA)作為最大的一類基因表達調控因子，miRNA通過與靶mRNA的3′-UTR區互補或部分互補的結合,使mRNA降解或介導其翻譯抑制，參與基因轉錄后水平調控，在細胞發育、增殖、分化和凋亡等生物學行為中發揮著重要作用[6]。本課題組證實，miR-155在免疫應答中起重要作用[7]。本文擬構建miR-155靶基因熒光素酶基因報告載體，驗證其與miR-155的對應關系，為下一步研究miR-155在吸入性肺損傷機制中的作用提供前期實驗室數據和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 Bio-ard chromo4熒光定量PCR儀(美國Bio-ard公司)，化學發光測定儀Luminometer(美國Promega公司)，基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)，Q3000型Quawell分光光度計(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)，L1低溫鏈接儀(珠海黑馬醫學儀器有限公司)，低溫臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)，恒溫CO2細胞培養箱(日本Sanyo公司)，Gen5酶標儀(美國生物科技公司)，超凈工作臺(蘇州尚田潔凈有限公司)，倒置顯微鏡、數碼相機(日本Olympus公司)，恒溫培養振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)，全自動雪花制冰機IMS-30(雪花電器有限公司)，DW-86L628超低溫保存箱(海爾集團)，M8/4R酶標洗板儀(日本Olympus公司)，可透射儀(北京金博益生物技術有限公司)，DYY-7C型電泳儀電泳(北京市六-儀器廠)。

1.1.2 主要試劑 質粒抽提試劑盒(美國Omega公司)，寡核苷酸片段(Invitrogen 公司)，膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，限制性內切酶HindⅢ、SpeⅠ、ApaⅠ、BamHI(廣州銳博有限公司)，2×ligation solution Master Mix(中科瑞泰生物科技有限公司)，DNA marker(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)，質粒中量制備試劑盒(AxyGen公司),溴化乙錠(ethidium bromide，EB)，瓊脂粉(美國Sigma公司)，GeneJammer轉染試劑(美國Stratagene公司)。

1.1.3 菌種及細胞 E.coli DH5α菌株、HEK-293AD細胞由解放軍總參謀部總醫院結核病研究所生物化學實驗室孫衛國博士惠贈：pMIR-REPORTTMLuciferace質粒受贈于Promega公司；pRL-TK質粒購自Promega公司，見圖1。

圖1 pMIR-REPORTTM Luciferace(A)和 pRL-TK(B)質粒圖譜

1.2 方法

1.2.1 miR-155的靶基因的預測 miR-155是人類第21號染色體非編碼轉錄本BIC第3個外顯子內，人、鼠、狗、猩猩，以及雞的基因組中廣泛存在；以數據庫miR Base(http://www.mirbase.org/)為基礎，同時參考TargetScan和PicTar軟件預測miR-155的靶基因，并結合文獻中報道與炎癥相關的基因作為進一步篩選的條件。

1.2.2 靶基因的載體的構建與鑒定

1.2.2.1 寡核苷酸序列的合成 從MirBase網站檢索miR-155,以鼠類為研究對象，選定mmu-miR-155,進入TargetScan網頁界面，獲取活化性T淋巴細胞核因子5(NFAT5) mRNA 3′-UTR與miR-155結合的序列,設計目標序列NFAT5和突變序列NFAT5-mu,包括：含有miR-155作用位點，并適當向上游和下游延伸5～10 nt，分別在5′端插入Hind Ⅲ和SpeⅠ酶切位點,以備后續連接之用,同時添加ApaⅠ酶切位點,以備后續鑒定。寡核苷酸基因片段由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

1.2.2.2 靶基因載體構建 退火：兩條寡核苷酸片段在1×的退火Buffer中，95 ℃變性5 min，每分鐘下降1 ℃直到30 ℃，作為與pMIR-REPORTTMLuciferace熒光素酶載體連接的插入片段。退火體系：互補寡核苷酸片段各0.5 μL，11.5 μL的 1×退火Buffer，終濃度2 ng/μL。目的基因片段保存4 ℃，長期不用可-80 ℃保存；pMIR-REPORT熒光素酶連接載體制備：采用感受態E.coli DH5α擴增LUC質粒，抽提質粒并凝膠提純，行限制性內切酶HindⅢ和SpeⅠ酶切和片段凝膠回收。HindⅢ和SpeⅠ酶切雙酶切體系：LUC質粒30.0 μL,雙蒸水4.0 μL，HindⅢ酶1.0 μL,SpeⅠ酶1.0 μL,10×Buffer 4.0 μL，L1低溫鏈接儀金屬浴37 ℃培養24 h；靶基因的連接：體系：目的基因 4.0 μL，連接載體 0.2 μL，2×連接緩沖液5.0 μL，雙蒸水 0.8 μL，L1低溫鏈接儀金屬浴16 ℃培養16 h。

1.2.2.3 轉化 120 μL E.coli DH5α感受態細胞冰水浴融化(1～2 min)，加入11 μL連接產物，置于冰水浴35 min，擦干離心管后置于42 ℃熱休克90 s，迅速置于冰水浴5 min；加入氨芐西林的LB液體培養基800 μL，37 ℃搖床培養1 h；吹打混勻沉淀，取300 μL細菌懸液均勻涂布與Amp+平板上，置于37 ℃恒溫箱培養10 h。

1.2.2.4 挑選菌落及重組質粒的鑒定 挑取白色光亮的單菌落，接種于5 mL的LB液體培養基，37 ℃搖床孵育6.5 h(致培養基變渾濁)，按質粒抽提試劑盒實驗步驟提取重組質粒；將提取的質粒載體，用ApaⅠ單酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳，待溴酚藍遷移至凝膠2/3處，用凝膠掃描系統檢測DNA的位置及條帶術； 將ApaⅠ單酶切檢測符合的樣品送北京博愛永華公司測序。

1.2.3 重組質粒轉染與雙熒光素酶活性檢測 轉染前24 h將2×105/mL的HEK-293AD細胞接種于96孔板,每孔加100 μL無抗1640培養基,當細胞生長密度至培養板底部的75%～80%時開始轉染。轉染分組:pMIR-NFAT5+miR-control組、pMIR-NFAR5+miR-155 mimics組、pMIR-NFAR5+miR-155+inhibitor組、pMIR-NFAT5-mu+miR-155 mimics組；各組中均轉入對照質粒pRL-TK,按每孔25.0 μL opti-MEM培養基稀釋0.5 μL LipofectmineTM2000脂質體,輕柔混合,室溫靜置5 min(小于25 min);按每孔量用25.0 μL opti-MEM培養基稀釋0.20 μg 報告載體、0.01 μg pMIR-TK 和0.375 μL寡核苷酸,輕柔混合;將兩者混合,室溫孵育 20 min。每組設3個復孔,分別將 50 μL質粒DNA-寡核苷酸-轉染試劑混合物加至 96 孔板中,稍微震蕩混勻,4 h后更換1640培養基,37 ℃ 細胞培養箱共培養24 h后。按照Dual LuciferaseTM報告基因檢測試劑盒說明書進行操作,在熒光儀檢測得到各組螢火蟲熒光素酶活性值(F)和海腎熒光素酶活性值(R),取F/R 為相對活性值進行數據統計。

2 結 果

2.1 靶向關系預測 應用3個軟件預測及相關文獻查閱，初步篩選出miR-155相關靶點是NFAT5和TRAF3(圖2)，miR-155與靶基因的3′-UTR序列部分互補，與NFAT5和TRAF3的“seed sequences”都在7-mer 以上。靶點預測結果設計的靶基因序列及突變的對照序列，見圖3。

圖2 miR-155與靶基因的3′-UTR 序列比對

圖3 靶基因序列及突變序列

2.2 靶基因的載體的構建與鑒定 將目的基因與PMIR-REPORT熒光素酶連接空載體連接,轉化擴增后提取重組質粒,進行酶切鑒定。行ApaⅠ單酶切可見重組質粒能夠線性化,比在pMIR-REPORTTMLuciferace質粒的條帶靠后,進一步測序證實插入片段與預期設計完全相符(圖4)。同時將上述目的連接產物送北京博艾永華公司測序,測序結果證實與設計合成的序列完全吻合，見圖5。

1:DNA分子標記物;2:NFAT5質粒;3:NFAT5質粒ApaⅠ單酶切;4:NFAT5-mu質粒 ApaⅠ單酶切;5:NFAT5-mu質粒。

圖4 ApaⅠ單酶切鑒定圖

圖5 靶基因及突變基因3′UTR測序結果

2.3 雙熒光素酶活性檢測 為了研究miR-155是否直接調控NFAT5的表達,本研究成功構建雙熒光素酶報告基因載體,通過Dua-l LuciferaseTM報告基因檢測系統檢測各組F和R,取F/R值，見圖6。

圖6 雙熒光素酶活性及比值

2.4 各組相對熒光素酶值比較 pMIR-NFAT5+miR-control組(2 295.83±563.50)與pMIR-TMEM33+miR155-mimics組(1 220.99±198.78)相對熒光素酶值比較差異有統計學意義(P<0.01);pMIR-NFAT5-MU+miR-155組(2 475.72±176.99)與pMIR-NFAT5+miR-control組相比，其相對熒光素酶值差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

吸入性肺損傷因發病機制錯綜復雜，其關鍵因素始終未能得到突破性進展。臨床研究和動物實驗均表明炎細胞浸潤、大量自由基生成及促炎癥介質在肺組織過度表達是煙霧吸入肺損傷的早期主要病理特征[8]。而NF-κB信號通路的激活誘導的失控炎癥反應起著重要的促進作用[9-11]。研究表明，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、IL-12、IL-10、巨噬細胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、環氧化酶-2(COX-2)及前列腺素等炎性因子都是NF-κB調控的下游基因。大量炎癥因子及炎癥因子間的級聯放大作用，加重吸入性肺損傷的進展。

NFAT5是一種廣泛表達的核轉錄因子，細胞外液滲透壓能能夠調節其活性，在腎、腦、肺、皮膚及眼等多種組織中表達[13]。除了在維持滲透壓有重要作用外，近些年的研究表明其在胚胎的形成和發育、肝臟解毒和腫瘤轉移方面都有重要的生物學作用。研究表明，血糖波動大的患者，血漿中促炎因子IL-6，IL-8和TNF-α等水平明顯增高，且患有糖尿病微血管并發癥的患者中，外周血單核細胞中NFAT5明顯增多，且與彈性反應增強子結合蛋白的DNA結合能力明顯增多[14]。在海水誘導的吸入性肺損傷模型中，肺組織中NFAT5及炎癥因子在mRNA和蛋白水平上表達量上升。并且體外實驗使用NFAT5 siRNA抑制NFAT5的表達后p-NF-κB 和炎癥因子水平的顯著下降[15]。因此，筆者猜想NFAT5與肺損傷關系密切，可能參與NF-κB信號轉導通路激活，從而調節吸入性肺損傷。

miRNA作為最大的一類基因表達調控因子，在維持自身的穩態，調節機體的生長發育及疾病的發生、發展方面起著重要的作用。miR-155參與機體對炎癥刺激的應答，維持機體的免疫功能[16-17]。研究表明，miR-155通過其靶基因IKK激酶家族、Smad2、Fas相關死亡蛋白等減少NF-κB通路的激活，以及次級效應方式抑制炎癥因子的表達，從而減少對機體的損傷。

本研究結果證實，miR-155能夠與NFAT5 mRNA-3′UTR互補結合，負向調控海參熒光素酶的表達。吸入性損傷的研究一直是國內外研究的焦點，本課題組立足miRNA，擬在ALI、NFAT5和NF-κB架起橋梁，在基因層面轉錄后水平研究ALI。本實驗成功構建熒光素酶報告基因重組質粒，并驗證miR-155對NFAT5基因mRNA 3′-UTR具有靶向調控作用。為進一步研究miR-155在吸入性肺損傷機制中的作用奠定了基礎。

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Construction of nuclear factor of activated T-cells 5 mRNA 3′-untranslated region reporter vector and targeting verification between NFAT5 and miR-155*

ShuBin1,LiWenting2,LiuZhen2,ZhangYajie2,YinBin2,ZhaoPan1,ZhangTongwei2,JiaChiyu2△

(1.GraduateSchool,HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou,Hebei075000,China;2.DepartmentofBurnandPlasticSurgery,the309thHospitalofPeople′sLiberationArmy,Beijing100091,China)

Objective To construct a Luciferace reporter vector containing the 3′ untranslated region (3′UTR) of NFAT5 and measure the correlation between NFAT5 and miR-155.Methods The miR-155 targeting NFAT5 3′UTR was predicted by Target Scan,Mir Base and Pic Tar.NFAT5 and mutant NFAT5 sequence(NFAT5-mu) were then designed and synthesized,and they were cloned into pMIR-REPORTTMLuciferace reporter vector.Human embryonic kidney-293AD (HEK-293AD) cells of the 4th passage were divided into 4 groups according to the random number table.cells in plasimd +miR-155 mimics groups were transfected with pMIR-NFAT5 recombinant plasimid,pRL-Tk plasmid and miR-155 mimics;cells in plasimd +miR-155 mutated groups were transfected with pMIR-NFAT5-mu recombinant plasimid,pRL-Tk plasmid and miR-155 mimics;cells in plasimd +miR-155 control groups were transfected with pMIR-NFAT5 recombinant plasimid,pRL-Tk plasmid and miR-155 Negative control;cells in plasimd +miR-155 inhibitor were transfected with pMIR-NFAT5 recombinant plasimid,pRL-Tk plasmid and miR-155 inhibitor;and were respectively transfected into together by liposome.After culture for 24 h,the luciferase activity was detected by dual luciferase reporter assay system.Results TargetScan,Miranda and PicTar shared the results that NFAT5 has the complementary binding sites with 3′UTR of miR-155.And luciferase reporter vectorwas constructed.Therefore the result of sequencing and double digesting of recombined plasmid were completely correct.Dual-luciferase reporter assay showed that miR-155 possesses a target effect on 3′UTR of NFAT5.Compared to the pMIR-NFAT5+miR-control group,the luciferase activity of the pMIR-NFAT5 +miR-1 55 mimics group was decreased,with statistically significant difference(P<0.01),while there was no significant difference at other time points(P>0.05).Conclusion The pMIR-NFAT5 recombinant plasmid and pMIR-NFAT5 recombinant mutated plasmid were confirmed with successful construction.and it was found that miR-155 can target NFAT5 mRNA 3′-UTR.The results provide the experiment data for further disclosing the mechanism of inhalation injury on the level of gene expression.

nuclear factor of activated T-cells 5;microRNA-155;luciferase reporter gene vector

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.08.001

國家自然科學基金面上資助項目(81372051;81670009)；總參軍事醫學和老年病科研基金項目(ZCWS14B06)；解放軍309醫院院管課題(2014MS-001)；北京市科技計劃“首都特色”專項基金資助項目(Z151100004015199)；全軍醫學科技青年培育項目(15QNP049)。 作者簡介：舒彬(1988-)，在讀研究生，主要從事燒傷整形、吸入性肺損傷相關研究。△

，E-mail:1922616763@qq.com。

R604

A

1671-8348(2017)08-1009-03

2016-09-21

2016-11-19)