兩株希木龍假絲酵母14α-去甲基化酶基因(ERG11)的克隆及其功能初步驗證

張浩，王千，劉偉

北京大學第一醫院皮膚性病科，北京大學真菌和真菌病研究中心，皮膚病分子診斷北京市重點實驗室，北京 100034

·論著·

兩株希木龍假絲酵母14α-去甲基化酶基因(ERG11)的克隆及其功能初步驗證

張浩，王千，劉偉

北京大學第一醫院皮膚性病科，北京大學真菌和真菌病研究中心，皮膚病分子診斷北京市重點實驗室，北京 100034

為探討希木龍假絲酵母(假絲酵母又稱念珠菌)的耐藥機制，首先克隆出兩株希木龍念珠菌ERG11基因，初步驗證其功能，從而為后續研究奠定基礎。從美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)基因數據庫中獲取白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌Erg11蛋白的保守序列，設計簡并引物，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增獲得希木龍念珠菌ERG11 cDNA部分片段；用快速cDNA末端擴增法(rapid amplification of cDNA ends，RACE)分別擴增其5′和3′端，獲得完整的ERG11編碼序列(coding sequence，CDS)；將CDS克隆到pYES2表達載體中，在尿嘧啶營養缺陷型釀酒酵母中過表達ERG11；用微量液基稀釋法檢測轉化后的釀酒酵母對氟康唑的敏感性，初步驗證其功能。結果顯示，簡并PCR擴增獲得預期708 bp片段，5′RACE和3′RACE分別獲得385 bp和1 336 bp片段，經純化、克隆、測序、比對分析，獲得兩株菌的ERG11 CDS；比對其編碼的蛋白，與其他念珠菌的Erg11蛋白高度同源；分別檢測克隆了這兩株希木龍念珠菌ERG11 CDS表達載體的釀酒酵母對氟康唑的敏感性，發現過表達ERG11明顯降低其對氟康唑的敏感性。結果提示，簡并PCR聯合RACE能準確有效地克隆出希木龍念珠菌ERG11基因，用pYES2釀酒酵母表達系統能初步驗證其功能。

希木龍假絲酵母；……