基于量子點/抗體探針采用電化學方法檢測水中微囊藻毒素

李 瑩， 孫秀蘭， 張銀志

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

基于量子點/抗體探針采用電化學方法檢測水中微囊藻毒素

李 瑩1， 孫秀蘭1， 張銀志*2

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

用量子點偶聯微囊藻毒素抗體作為探針，經過間接競爭反應之后，通過方波溶出伏安法測定Cd2+的濃度，從而實現對水中微囊藻毒素含量的檢測。分別對緩沖液pH、濃度、沉積電位、沉積時間等因素進行優化。實驗結果表明：Cd2+在-0.768 V左右會出現一個靈敏的溶出峰，在最優實驗條件下進行檢測，峰電流值與微囊藻毒素濃度的對數值在一定范圍內呈良好的線性關系，線性范圍在0.1～8 μg/L之間，線性方程為y=-196.66x+242.15，相關系數R2=0.992 45，檢出限為0.08 μg/L，加標回收率為91.0%～108.6%，相對標準偏差為2.97%～6.98%。

微囊藻毒素；量子點；鎘離子；方波溶出伏安法

近年來，隨著工農業的快速發展，水體富營養化程度日益加劇，使得藻類植物大量繁殖。藻細胞死亡后會向水中釋放體內毒素，其中以微囊藻毒素（microcystin，MC）最為常見。大量研究表明，MC具有強烈的毒性，嚴重威脅動植物及人類的健康。WHO規定飲用水中微囊藻毒素（MC-LR）的含量不得超過1 μg/L[1-3]。但是由于MC化學性質較為穩定，具有耐高溫、耐pH值變化、水溶性好等特點，使得MC很難被去除[4]，因此建立起快速有效的檢測方法顯得尤為重要。常見的ML檢測方法有HPLC，LC-MS等，但因前處理復雜、儀器昂貴、操作復雜、耗時長等原因[5-7]，一定程度上限制了它們的應用推廣。量子點（Quantum dots，QDs），是一類由II—VI族（如 CdSe、CdTe、ZnSe、CdS等）或 III—V族 （如InAs、InP等）以及Si等元素組成的均一或核殼結構的納米顆粒，是近年發展起來的一種新型納米材料。它具有激發光譜寬、發射光譜窄、光穩定性好等眾多優點，已經吸引越來越多研究者的注意[8-9]。

本文中首先通過水相制備CdTe量子點，然后將其與微囊藻毒素抗體通過EDC偶聯，經過間接競爭反應之后，用硝酸將量子點中的Cd2+溶出，最終通過方波溶出伏安法（SWSV）對Cd2+進行檢測，從而實現對微囊藻毒素的定量分析。該方法將抗原抗體特異性反應與電化學的便捷性相結合，具有靈敏度高、特異性強、快速方便等優點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

碲粉（質量分數99.9%），CdCl2·2.5H2O，硼氫化鈉（質量分數＞96%），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），巰基乙酸，十二烷基磺酸鈉，丙烯酰胺，N-N亞甲基雙丙烯酰胺，TEMED，過硫酸銨，考馬斯亮藍R-250，甲醇，甘氨酸，濃硝酸等，購自國藥集團化學試劑有限公司；所用試劑為分析純，實驗用水均為超純水；緩沖溶液等，由實驗室配制；微囊藻毒素標準品及抗原，購自Sigma公司，抗體為作者所在實驗室免疫所得；洗滌液為含有體積分數0.05%Tween-20的PBS（pH 7.4），封閉液為含有3 g/dL BSA的PBS溶液。

1.2 儀器

CHl660D型電化學工作站，上海辰華儀器有限公司產品；三電極系統：玻碳電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極；KQ-50E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；TecnaiG2F20s-TWIN型透射電鏡，美國FEI公司產品；Tanon GLS-2010型凝膠成像儀，上海天能科技有限公司產品；PB-10/C型標準型PH計，上海精密儀器有限公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 量子點的制備及與抗體的偶聯 稱取120 mg硼氫化鈉，溶于5 mL超純水中，在氮氣的保護下快速加入40 mg碲粉，常溫磁力攪拌直至黑色碲粉完全溶解，反應液最終為無色（或粉紅色）透明。稱取0.145 g CdCl2·2.5H2O，用超純水溶解于三口燒瓶中，加入適量巰基乙酸（TGA）（Cd∶Te∶TGA=1∶0.5∶2.4，摩爾比），用0.1 mol/L的NaOH調解溶液pH值至最佳，通氮氣20 min左右，排出體系中的氧氣，然后在氮氣保護下迅速加入新鮮制備的碲氫化鈉溶液，強力攪拌，100℃加熱回流。將制備好的量子點避光冷卻至室溫，取出適量量子點，用甲醇進行離心純化，以便去除未反應的物質[10-11]，將所得沉淀真空干燥過夜，干燥后用超純水復溶。

取1 mL純化后的量子點溶液，加入20 μL的EDC（100 mmol/L），振蕩10 min左右，加入適量微囊藻毒素抗體，37℃反應2 h。用100 kD的超濾離心管對樣品進行離心純化，去除未結合的量子點及其他雜質，將截留的QDs-Ab偶聯物用超純水復溶，4℃密閉保存備用[12]。

1.3.2 裸電極的預處理 將玻碳電極分別用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3打磨拋光，分別在乙醇和超純水中超聲2 min左右，然后在2.5 mmol/L HAuCl4溶液中于-0.2～0.6 V掃描至得到穩定的循環伏安圖[13]。

1.3.3 間接競爭法 將MC抗原用碳酸鹽緩沖溶液稀釋至0.25 μg/mL，每孔100 μL，4℃過夜，取出板條，用洗滌液清洗后，每孔加入含質量濃度3 g/dL BSA的PBS溶液250 μL，以封閉非特異性結合位點，37℃反應2 h，清洗后，每孔分別加入50 μL不同質量濃度的MC標準品和50 μL QDs-Ab，37℃反應1 h后清洗[14]，然后每孔加入1 mol/L的HNO3，使得結合在孔板上的量子點中Cd2+溶出，然后吸取20 μL混合液加入到10 mL緩沖溶液中。

1.3.4 Cd2+的檢測 在三電極體系下按照預先設定好的條件進行測試，因為氧氣的存在會增加背景電流，所以測試前先向緩沖液中通氮氣5 min以除去溶液中的溶解氧[15]。然后將電極浸入含有一定濃度Cd2+的緩沖溶液中，適當攪拌，在一定電位下富集，沉積完成后，將溶液靜置片刻，最后再掃描溶出。以溶出峰電流作為標準，控制變量，對檢測條件進行優化。掃描范圍：-1.2～-0.1 V；測定條件：電位增量0.004 V/s，方波頻率25 Hz，振幅25 mV，平衡時間10 s，清洗電位0.3 V，清洗時間60 s。所有測試均在室溫下進行，實驗原理如圖1所示。

圖1 實驗流程圖Fig.1 Flow diagram of this experiment

2 結果與分析

2.1 量子點表征及偶聯結果鑒定

通過CdTe量子點的透射電鏡圖（見圖2），可以看出，制備的量子點分散性良好，形狀接近球形，粒徑比較均一。

對QDs-Ab偶聯物進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，各道上樣的樣品及上樣量分別是：1泳道為10 μL標準蛋白Marker，2泳道為10 μL量子點，3泳道為 10 μL微囊藻毒素抗體，4泳道為 10 μL QDs-Ab偶聯物，5泳道為 20 μL QDs-Ab偶聯物。電泳結束后，用凝膠成像儀對其進行透射拍照[16]，獲得圖3（a）。然后將凝膠在染色液中浸泡15 min，再進行脫色處理，直到背景顏色完全脫掉為止，用成像儀對凝膠再次進行拍照，獲得圖3（b）。

未標記的抗體（或Marker）不會產生熒光，透射拍照也就不會產生亮帶。而量子點有熒光，所以在紫外照射下會有條帶，如圖 3（a）所示，2、4、5泳道都有亮光，并且QDs-Ab偶聯物（4，5泳道）亮光的強度會隨著上樣量的增加而增強。在考馬斯亮藍染色之后，圖3（b）所示，QDs（2泳道）無條帶，Marker，抗體及QDs-Ab均有明顯的條帶，兩者結合表明QDs與Ab偶聯成功。

圖3 偶聯物透射和照射電泳圖Fig. 3 Transmission electrophoresis and exposure electrophoresis of QDs-Ab conjugates

2.2 檢測條件優化

2.2.1 差分脈沖溶出伏安法與方波溶出伏安法對比 對金屬離子的溶出分析分為兩步，首先在一定電位下將金屬離子富集到電極，然后再施加電壓，使其溶出，由于溶出時可采用不同掃描方式，因此溶出峰的電流大小也不一樣。根據參考文獻可知，對Cd2+的檢測通常采用差分脈沖溶出伏安法（DPV）和SWSV這兩種方法，因此首先在合適的條件下將Cd2+沉積到電極上，然后改變掃描方式，使其重新溶出，以溶出峰電流作為指標，從中選擇出最優的檢測方法。如圖4所示，在相同的測量條件下，采用兩種溶出方法對同一濃度的Cd2+進行檢測，可以看出SWSV所得到的峰型更好，峰電流也更大，故采用SWSV對鎘離子進行檢測。

2.2.2 硝酸用量 取出包被好的板條，清洗后，加入相同質量濃度的MC和QDs-Ab，37℃反應1 h之后清洗，然后分別加入20、30、40、50、60、70、80 μL的1 mol/L HNO3，輕微晃動，然后從中吸取20 μL加入緩沖溶液中，采用SWSV方法進行檢測，如圖5所示，隨著HNO3用量的增加，溶出峰電流逐漸增大，但當HNO3用量超過40 μL之后，電流又開始降低，這可能是由于HNO3用量較少時，不足以將板條中的Cd2+全部溶出，而當HNO3用量過大時，又起到了稀釋的作用，降低了Cd2+的濃度，使得溶出峰電流降低，因此本實驗中選擇加入40 μL的HNO3。

圖4 不同檢測方法的比較Fig.4 Comparison of different detection methods

圖5 硝酸用量的優化Fig.5 Optimization of the amount of nitric acid

2.2.3 緩沖溶液的優化 緩沖液的種類對金屬離子的電流大小和峰電位均有較大影響，因此選擇合適的緩沖溶液可以有效提高檢測的靈敏度。因為金屬離子的測定通常在酸性環境[17]，因此在pH=5的情況下，配制幾種常見的緩沖溶液（磷酸鹽，醋酸鹽，Tris-HCl，檸檬酸-檸檬酸鈉），如圖6（a）所示，Cd2+在磷酸鹽緩沖液中的峰電流值最高，峰型最好，因此選擇磷酸鹽緩沖液作為支持電解質溶液。

配制pH為2～9的磷酸鹽緩沖溶液，檢測不同pH下溶出峰電流的變化，如圖6（b）所示，溶出峰在pH為3時開始出現，隨著pH值的增加，峰電流先增加再降低，在pH為5時達到最大，這可能是由于Cd2+在弱酸環境中的沉積能力要強于強酸環境，而在堿性條件下，Cd2+易發生水解，使得電極對它的吸附能力減弱，從而導致峰電流降低[18]。

配制不同濃度的磷酸鹽緩沖溶液，在相同條件下對同一濃度的Cd2+進行檢測，如圖6（c）所示，隨著緩沖液濃度的增加，溶出峰的值也在不斷增加。這是由于隨著電解質的濃度的升高，更多的離子可以參與到電極表面的反應，使得電極表面電子遷移速率增大，進而使得溶出峰電流值增加[19]，當緩沖液濃度達到0.1 mol/L之后，電流值增加速度減緩，且溶出峰的峰形也會發生一些偏移，因此選擇濃度為0.1 mol/L的緩沖溶液。

圖6 不同條件的優化Fig.6 Optimization of different conditions

2.2.4 沉積電位和沉積時間 沉積過程是指游離的Cd2+在某一電位下被還原成鎘單質富集在電極表面，因此沉積電位的選擇對隨后的溶出峰測定具有很大的影響。沉積電位如果離溶出峰的電位太近，可能會造成溶出峰電流不穩定，甚至會導致Cd2+無法在電極表面富集，而沉積電位如果過負則可能引起干擾，直接影響測定結果[20]。本文中試驗了-1.4～-0.8 V的沉積電位，如圖7（a）所示，隨著沉積電位的增大，Cd2+溶出峰的值逐漸增大，當沉積電位為-1.2時，峰電流值最高，但隨著電位的繼續增加，峰值反而開始下降，所以選擇最佳沉積電位為-1.2 V。此外，在沉積過程中對溶液進行適當的攪拌，可以有效提高Cd2+的沉積效率。但應該控制好攪拌速度，不可過快，否則易使溶液形成漩渦。

沉積時間對溶出峰電流也會產生影響，在一定時間范圍內，隨著沉積時間的增加，沉積到電極上的Cd2+會增多，則溶出峰的電流值也會增高，本文比較了沉積時間從60 s增加到480 s時溶出峰電流的變化，如圖7（b）所示，在300 s之前，峰電流會隨著沉積時間的增加而增大，但當沉積時間超過300 s后，溶出峰的值增加很緩慢甚至還略有下降，這可能是由于隨著時間的延長，電極上沉積的Cd2+達到飽和，并且在電極表面形成的沉積膜，厚度增加，從而影響了電子的傳輸[21]，導致峰電流的下降。所以最終選擇300 s作為沉積時間。

圖7 沉積電位和時間的優化Fig.7 Optimization of deposition potential and deposition time

2.3 線性范圍及檢測限

在最佳檢測條件下，采用SWSV，對不同濃度的微囊藻毒素進行測量，如圖所示，Cd2+方波溶出檢測的出峰電位大約在-0.768 V，當濃度在0.1～8 μg/L之間，微囊藻毒素濃度的對數值與峰電流具有良好的線性關系，回歸方程為：y=-196.66x+242.15，R2= 0.992 45，檢測限可達0.08 μg/L。

圖8 線性擬合曲線Fig.8 Linear fitting curve

2.4 重現性

分別對質量濃度為0.25、2 μg/L的微囊藻毒素標準溶液連續測定10次，如表1所示，測得的相對平均偏差分別為2.38%、4.42%，表明該方法具有良好的重現性。

表1 重復性實驗Table 1 Repeatability test

2.5 樣品分析

在最優條件下，對飲用水、校園湖水（若湖水濁度過大，則測定之前先用0.45 μm的濾膜抽濾）兩種水樣進行檢測，并同ELISA檢測結果相比較，此外對兩種水樣進行加標回收實驗，采用標準加入法，分別向水樣中加入不同濃度的微囊藻毒素標準品（每個濃度平行測定5次）。結果如表2所示，本法的測定結果與ELISA基本相符，所測樣品的回收率為91%～108.6%，標準偏差為2.97%～6.98%。

表2 實際水樣中MC的檢測Table 2 Detection results of MC in water samples（n=5）

3 結語

本研究中利用CdTe量子點為媒介，將抗原抗體的特異性反應與電化學的溶出分析方法相聯系，通過SWSV對Cd2+的分析，從而間接實現對微囊藻毒素的定量檢測。該方法保留了溶出分析法靈敏度高，操作簡單快速等傳統優點，并且由于抗原抗體的特異性反應，可以有效排除雜質干擾。在最優檢測條件下，該方法的檢測限可達0.08 μg/L，且線性范圍較寬。對水樣的加標回收實驗及實際樣品檢測，結果表明該方法在檢測實際水體中的微囊藻毒素具有很好的應用前景。

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Determination of Microcystin in Water Using Electrochemical Method Based on Quantum Dot/Antibody Probe

LI Ying1， SUN Xiulan1， ZHANG Yinzhi*2
(1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

With the probe of quantum dots coupled with microcystin antibody（QDs-Ab），the content of microcystin was determined by measuring cadmium ions released from QDs based on square wave stripping voltammetry after indirect competitive reaction.The electrochemical response was optimized with respect to pH，buffer concentration，deposition potential，deposition time and so on.Results showed that the sensitive stripping peak potential of cadmium ions was about-0.768 V. Under the optimal conditions，the peak current was linear with the logarithm of microcystin concentration in the range of 0.1～8 μg/L and the equation of regression was y=-196.66x+242.15（R2=0.994 8）with a detection limit of 0.08×10-9.The recovery of standard addition experiment was in the range of 91%～108.6%with the relative standard deviation of 2.97%～6.98%.

microcystin，quantum dots，cadmium ions，square wave stripping voltammetry（SWSV）

X 82；O 661；TS 201

A

1673—1689（2017）02—0136—07

2015-03-21

國家973計劃項目 （2012CB720804）；國家自然科學基金委員會-廣東省人民政府自然科學聯合基金項目（U1301214）；2010年度公益性行業（農業）科研專項（201003008-08）。

*通信作者：張銀志（1975—），男，陜西漢中人，高級工程師，主要研究方向為食品安全檢測與分析。E-mail：yinzhizhang@jiangnan.edu.cn

李瑩，孫秀蘭，張銀志.基于量子點/抗體探針采用電化學方法檢測水中微囊藻毒素[J].食品與生物技術學報，2017，36（02）：136-142.