載納米銀絲蛋白/海藻酸鈉海綿的制備及表征

陳雍， 趙朋，鄧超， 陳敬華

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

載納米銀絲蛋白/海藻酸鈉海綿的制備及表征

陳雍， 趙朋，鄧超， 陳敬華*

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

以絲蛋白（SF）和海藻酸鈉（SA）為基質構建新型負載納米銀生物敷料。以SF溶液為穩定劑，采用紫外光照射法合成了納米銀，加入SA后，經氯化鈣/乙醇/水（摩爾比，1∶71∶77）處理3 h，將上述材料潤洗凍干后得到負載納米銀的SF/SA復合海綿 （AgNPs-SF/SA）。透射電子顯微鏡（TEM）觀察顯示，合成的納米銀平均粒徑為（5.03±1.42）nm，在絲蛋白溶液中分布均勻。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示，與純絲蛋白海綿相比，AgNPs-SF/SA顯示連通的多孔結構。SA的加入增強了海綿的吸水性和保水性；在SF和SA的協同作用下，AgNPs-SF/SA的水蒸氣透過率有所提高。以K-B擴散法和菌液培養法測定了AgNPs-SF/SA的抗菌性，結果顯示，AgNPs-SF/SA對金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌的抗菌性優于陽性對照AQUACEL?Ag；24 h和48 h的菌液培養顯示，AgNPs-SF/SA具有更持久的抗菌活性。綜上所述，AgNPs-SF/SA的物理性能和抗菌性能優良，有望作為一種新型的抗菌生物敷料用于預防和治療創面感染。

生物敷料；抗菌活性；絲蛋白；海藻酸；納米銀

感染是燒創傷護理過程中最為常見的并發癥之一，可以導致微生物入侵，阻礙表皮組織的再生和修復，延遲傷口愈合，促使瘢痕形成，甚至威脅患者的生命安全[1-2]。因此，預防和治療創面感染始終是傷口修復的重要前提。目前，通過創面局部應用廣譜抗生素來防治感染會產生細菌耐藥及可能存在過敏和毒性風險，且臨床上通常將抗菌材料與棉織物復合使用，生物相容性差，不利于創面的修復[3-4]。因此，制備載有安全，廣譜抗菌劑的生物敷料對創面修復具有重要意義。

納米銀作為微生物抗菌劑具有長久的歷史，因其本身具有持久、高效、廣譜的抗菌優點，在抗生素應用具有局限性的現狀下受到廣泛關注[5]。由于具有獨特的小尺寸效應和表面效應，即使在低濃度下納米銀也能輕易進入病原體發揮殺菌作用[6-8]。因此將納米銀引入以生物大分子材料為基質的生物敷料中能夠提高敷料的抗菌性能。

絲蛋白是蠶絲經脫膠得到的一種無生理活性的天然高分子材料，不僅來源豐富，價格低廉，而且具有良好的生物相容性，生物可降解性，能促進細胞的吸附及增長，具有較低的炎癥反應，其在醫用生物敷料，藥物載體等方面的研究日趨廣泛和深入[9-10]。并且絲蛋白能作為穩定劑，分散劑及催化劑在光照條件下還原納米銀，為納米銀的引入提供了簡便綠色的方法[11]。但是一些研究表明用乙醇處理的絲蛋白海綿存在較高疏水性[12]，凍干的絲蛋白海綿機械性能差[13-14]，限制了其在醫學材料領域的應用發展。海藻酸鈉應用于醫用敷料具有高吸濕性，高透氧性及良好的生物降解性及生物相容性，海藻酸鈉的引入能改善復合材料的機械物理性能，以滿足復合材料在醫學敷料方面的應用[15]。

1 材料與方法

1.1 原料及所用儀器

蠶繭，購于安徽兄弟藥業有限公司；海藻酸鈉（CP，相對分子質量300 000），國藥集團（上海）化學試劑有限公司；水解酪蛋白瓊脂培養基（M·H瓊脂培養基），上海科瑪嘉微生物技術有限公司產品；水解酪蛋白肉湯培養基（M·H肉湯培養基），廣東環凱微生物科技有限公司產品；金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌，無錫市第三人民醫院檢測科提供；其他試劑均購自國藥集團（上海）化學試劑有限公司。AQUACEL?Ag型銀離子敷料購自康維德（中國）醫療用品有限公司。

UV-1800型紫外可見分光光度計，島津國際貿易（上海）有限公司產品；JEM-2100型透射電子顯微鏡，日本JEOL公司產品；S-4800型掃描電子顯微鏡，日本日立儀器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 絲蛋白溶液的制備 稱取10 g剪碎的蠶繭，置于煮沸的碳酸鈉（0.02 mol/L）溶液45 min，用去離子水洗凈，烘干，得到干燥脫膠的絲素蛋白。將干燥脫膠的絲素蛋白溶解于氯化鈣/乙醇/水（摩爾比= 1∶2∶8）溶液，70℃水浴加熱1 h，振蕩，使絲蛋白充分溶解，待溶液冷卻后，12 000 r/min離心20 min，除去不溶雜質，透析3 d，得到干凈脫膠絲蛋白溶液。在此方法下獲得的絲蛋白，其數均分子量為110 000[16]。

1.2.2 納米銀的合成 將0.68 g/dL硝酸銀按體積比1∶4加入1.5 g/dL絲蛋白溶液中，置于365 nm紫外燈下反應6 h，即得到含納米銀的絲蛋白溶液。

1.2.3 載納米銀絲蛋白/海藻酸鈉復合海綿的制備3%海藻酸鈉溶液與上述含納米銀絲蛋白溶液按體積比1∶1混合，將共混溶液除去氣泡注入模具中，置于-20℃中預凍2 h，-80℃過夜，凍干。取出凍干樣品，用氯化鈣/乙醇/水（摩爾比=1∶71∶77）溶液浸泡處理，緩慢振蕩3 h，用去離子水洗凈，凍干，得到含納米銀絲蛋白/海藻酸鈉復合海綿。本實驗中，0.006 g海藻酸鈉與9.36×10-7mol Ca2+發生交聯，由此計算得到海藻酸鈉羧基與Ca2+的交聯度近似為6%。

1.2.4 納米銀及復合海綿的結構表征 取2 mL載納米銀絲蛋白溶液置于石英池中，用紫外-可見分光光度計在200～900 nm范圍內掃描，記錄圖譜。用JEM-2100型透射電子顯微鏡觀察粒子粒徑與形態。用S-4800型場發射掃描電子顯微鏡在加速電壓1.0 kV條件下觀察材料形貌和納米銀分布。

所以，運用數學史應該有中西數學價值觀以及社會政治、文化差異的介紹與對比。其中，最重要的是讓學生正確認識我們民族的數學在世界數學發展中的地位，并了解其配合西方數學的過程中發生了怎樣的改變，思考今后應如何更好發展，只有這樣才能更好地認識中國傳統數學的形式、價值觀，促進其對所學數學的理解和認識。

1.2.5 復合海綿的吸水性、保水率及水蒸氣透過率表征

1）平衡吸水倍率（g/g）[17]：干燥海綿樣品（W0）在磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）浸泡30 min，待其完全溶脹后，輕輕拭去樣品表面液體，稱重（Wt）。樣品平衡吸水倍率按式（1）計算：

2）保水率[18]：將完全溶脹于磷酸鹽緩沖液（pH= 7.4）的樣品（Ws）置于有濾網的離心管內，500 r/min離心3 min，稱重（W）。樣品保水率按式（2）計算：

3）水蒸氣透過率（WVTR）[19]：參照美國標準局公布的ASTME96—00方法，將干燥樣品覆蓋于裝有10 mL去離子水的燒杯杯口，密封杯口邊緣防止水汽損失，稱重（W0）然后置于干燥器中保持溫度37℃，相對濕度79%。以無覆蓋物的燒杯為空白對照，24 h后取出稱重（Wt），測燒杯表面積A。樣品水蒸氣透過率按式（3）計算：

1.2.6 復合敷料抗菌性能測定

1）抑菌圈法定性分析。取銅綠色假單胞菌和金黃色葡萄球菌于M·H肉湯培養基中復蘇，在37℃恒溫培養箱中緩慢振蕩（120 r/min），培養過夜。然后用M·H肉湯培養基將細菌懸浮液稀釋至600 nm處OD值為0.08～0.1。用滅菌后的棉球蘸取菌液，反復均勻的涂布于M·H瓊脂培養基上，用鑷子輕輕將直徑1.0 cm的海綿樣品貼在帶菌培養基平板上，37℃孵箱中培養24 h，測定抑菌圈大小。以含銀商品敷料AQUACEL?Ag作為陽性對照。用游標卡尺測量抑菌圈寬度，根據國標GB/T 20944.1—2007抗菌效果評價[20]計算

上式中，H為抑菌圈寬度；D為抑菌帶外徑的平均值（mm）；d為樣品直徑（mm）。

2）試管法定量分析。取銅綠色假單胞菌和金黃色葡萄球菌于肉湯培養基中復蘇，在37℃恒溫培養箱中緩慢振蕩（120 r/min），培養過夜。然后用M· H肉湯培養基將細菌懸浮液稀釋至600 nm處OD值0.07，將直徑為1.0 cm的海綿樣品浸沒在裝有2 mL細菌懸浮液的滅菌試管中，在37℃孵箱中培養24 h，測細菌懸浮液OD值。以含銀商品敷料AQUACEL?Ag作為陽性對照。

2 結果與討論

2.1 納米銀的表征

2.1.1 紫外可見分光光度計（UV-vis）測定 如圖1所示，在絲蛋白溶液中，納米銀在波長430～450 nm產生明顯特征吸收峰，并且隨著時間延長，納米銀吸收強度增強，表明隨著反應時間的延長，越來越多的銀被還原成的單質銀聚集成納米銀，溶液中的銀主要以納米粒子的形式存在。該結果表明在絲蛋白溶液中利用光化學還原反應成功合成納米銀。Xiang等[11]在絲蛋白溶液中合成穩定的納米銀，能在避光或光照下保存30 d，絲蛋白可以作為納米銀合成的良好穩定劑，分散劑及催化劑。納米銀可在自然光照反應合成，但是自然光照條件不易控制，紫外燈照射條件易控制，反應效率高，能快速合成納米銀[11，21]。

圖1 納米銀的紫外-可見光譜圖Fig.1 UV-Vis absorption spectra of nano-silver in the SF solution

2.1.2 透射電子顯微鏡（TEM）觀察 如圖2所示，所得納米銀近似球形，平均粒徑（5.03±1.42）nm，銀均勻分散在絲蛋白溶液中，無團聚現象。在反應過程中絲蛋白可以作為納米銀合成的良好穩定劑，分散劑及催化劑，反應過程不需添加其他任何化學物質，減少反應過程中其他物質的形成與干擾。形成的納米銀粒徑小，這有利于提高其與細胞的有效接觸面積，使其發揮更強的抗菌性能[7，22]。

圖2 絲蛋白溶液中納米銀的TEM圖和粒徑大小分布圖Fig.2 TEM image of the AgNPs in SF solution and distribution of particle size

2.2 復合海綿的形貌觀察

由圖3可知，交聯后的復合海綿樣品的微觀結構呈規則均一的多孔結構，相較于純絲蛋白海綿樣品，孔徑增大且排列更加規則。孔徑的增大提高了材料的吸水性和透氣性，同時有利于細胞的吸附和納米銀的釋放，增加了納米銀同細菌的接觸反應起到抗菌效果，這為材料應用于生物敷料提供了有利條件。

2.3 海綿樣品的吸水性、保水性及水蒸氣透過率性能

圖3 樣品SEM圖Fig.3 SEM images of sponges

由圖4（a）可知各個海綿樣品均具有良好的吸水性能，且實驗過程復合海綿能在極短時間內達到溶脹平衡。純絲蛋白本身具有較高的溶脹性能，溶脹平衡時吸水量是本身材料的22.7倍，復合海綿溶脹平衡的吸水量達到材料本身39.7倍，材料的吸水性明顯得到提高。海藻酸鈉的引入增加了材料的親水基團。其次，材料的孔徑也隨之增大，使得吸水性增強，能有效吸取傷口滲出液，為創面修復維持理想環境，同時減少感染風險。圖4（b）顯示復合海綿的保水率較純絲蛋白保水率有所提高，接近純海藻酸鈉保水率，親水基團的增加及海藻酸鈉的加入使海綿成規則片狀網絡結構，提高了樣品的儲水能力。圖4（c）結果表明復合海綿的水蒸氣透過率均高于單組份海綿，較空白對照降低323.12 g/（m2·d）。避免了水蒸氣的過度損失造成傷口過分干燥，同時也避免大量滲出液積累延緩傷口愈合，為創面提供了一個相對濕潤環境。

圖4 海綿樣品的物化性能Fig.4 PropertiesofhomogenousSF，AgNPs-SF/SA composite and homogenous SA sponges

2.4 抑菌性能測定

金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌是傷口感染的常見革蘭氏陽性球菌和革蘭氏陰性桿菌。由圖5可見，復合海綿周圍形成明顯抑菌圈，對金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌的抑菌帶寬度分別為（2.51±0.14）mm、（1.82±0.15）mm，未添加硝酸銀的絲蛋白/海藻酸鈉復合海綿周圍無明顯抑菌圈。根據國標GB/T 20944.1—2007抗菌效果評價[20]，結果表明AgNPs-SF/SA復合敷料對金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌的抗菌效果好。

圖5 平板法測定海綿的抗菌性能比較圖Fig.5 Antimicrobial properties against S.aureus and P. aeruginosa as evaluated by the Kirby-Bauer method

圖6（a）與（b）分別為24 h時浸有樣品與對照組的細菌生長情況圖，圖片顯示AgNPs-SF/SA復合樣品浸沒的細菌懸浮液顏色清亮，表明很少細菌繁殖，空白對照呈渾濁狀態，表明細菌生長良好，與平板法所得結果相應。圖6（c）與（d）分別為各時間點所對應的OD值，結果顯示在12 h時樣品浸沒的金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌細菌懸浮液OD值分別為0.13和0.10，均與陽性對照無顯著性差異，與陰性對照具有顯著性差異。在12 h以后陽性對照浸沒的金黃色葡萄球菌及銅綠色假單胞菌細菌懸浮液OD值均顯著上升，在24 h時分別達到1.15和1.13，樣品浸沒的銅綠色假單胞菌懸浮液OD值上升至0.7，由此可知樣品對金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌均具有高效、持久的抗菌效果，抗菌效果均優于陽性對照，且對金黃色葡萄球菌的抗菌效果優于銅綠色假單胞菌。

圖6 24 h金黃色葡萄球菌與銅綠色假單胞菌懸浮液圖及不同時間點金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌懸浮液OD值Fig.6 Photos of S.aureus and P.aeruginosa solutions after the growth for 24 h and the time courses of OD valuesofS.aureusand P.aeruginosa solutions

3 結語

本研究中利用光學還原法在可溶性絲蛋白溶液中合成納米銀，并通過氯化鈣/乙醇/水交聯得到載納米銀絲蛋白/海藻酸鈉復合海綿。納米銀在絲蛋白溶液中分散性好，無團聚現象，平均粒徑在5.03 nm，所得到的該復合材料具有均一的多孔結構，且具有較高的吸水性和保水率，水蒸氣透過率良好，對典型的創面感染細菌金黃色葡萄球菌及銅綠色假單胞菌敏感性強，抑菌效果良好，有望成為新型的納米銀抗菌生物敷料。

[1]SEETHARAMAN S，NATESAN S，STOWERS R S.A PEGylated fibrin-based wound dressing with antimicrobial and angiogenic activity[J].Acta Biomater，2011，7（7）：2787-2796.

[2]BARAJAS N L A，LOPEZ A J，ROQUE I F M.Antibiotic prophylaxis for preventing burn wound infection[J].Cochrane Database Syst Rev，2013（6）：D8738.

[3]OVINGTON L G.The truth about silver[J].Ostomy Wound Manage，2004，50（9A Suppl）：1S-10S.

[4]ZENG Xiaofeng，WEI Kun，HAN Xue.Preparation and propertiesof chitosan/polyvinyl alcohol loaded with nano-silver for wound dressing[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue EngineeringResearch，2011，15（8）：1413-1416.（in Chinese）

[5]RAI M，YADAV A，GADE A.Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials[J].Biotechnol Adv，2009，27（1）：76-83.

[6]MADHUMATHI K，SUDHEESH K P T，ABHILASH S.Development of novel chitin/nanosilver composite scaffolds for wound dressing applications[J].Journal of Materials Science：Materials in Medicine，2010，21（2）：807-813.

[7]MORONES J R，ELECHIGUERRA J L，CAMACHO A.The bactericidal effect of silver nanoparticles[J].Nanotechnology，2005，16（10）：2346-2353.

[8]SONDI I，SALOPEK S B.Silver nanoparticles as antimicrobial agent：a case study on E.coli as a model for Gram-negative bacteria[J].Journal of Colloid Interface Science，2004，275（1）：177-182.

[9]WENK E，MERKLE H P，MEINEL L.Silk fibroin as a vehicle for drug delivery applications[J].Journal of Controlled Release，2011，150（2）：128-141.

[10]REN Y，ZHOU Z，LIU B.Preparation and characterization of fibroin/hyaluronicacid composite scaffold[J].International Journal of Biological Macromolecules，2009，44（4）：372-378.

[11]FEI X，JIA M，DU X.Green synthesis of silk fibroin-silver nanoparticle composites with effective antibacterial and biofilm-disruptingproperties[J].Biomacromolecules，2013，14（12）：4483-4488.

[12]WONGPANIT P，RUJIRAVANIT R.Combinatorial effects of charge characteristics and hydrophobicity of silk fibroin on the sorption and release of charged dyes[J].Journal of Biomaterials Science，Polymer Edition，2012，ahead-of-print（ahead-ofprint）：1-17.

[13]TIYABOONCHAI W，CHOMCHALAO P，PONGCHAROEN S.Preparation and characterization of blended Bombyx mori silk fibroin scaffolds[J].Fibers and Polymers，2011，12（3）：324-333.

[14]KIM M K，KWAK H W，KIM H H.Surface modification of silk fibroin nanofibrous mat with dextran for wound dressing[J]. Fibers and Polymers，2014，15（6）：1137-1145.

[15]ZHAN Yizhen，ZHU Ping，ZHAO Xue.The preparation and development of alginate fiber in medical dressings[J].Technical Textiles，2007，25（8）：39-44.（in Chinese）

[16]CHO H J，KI C S，OH H，et al.Molecular weight distribution and solution properties of silk fibroins with different dissolution conditions[J].International Journal of Biological Macromolecules，2012，51（3）：336-341.

[17]MAO J S，ZHAO L G，YIN Y J.Structure and properties of bilayer chitosan-gelatin scaffolds[J].Biomaterials，2003，24（6）：1067-1074.

[18]HE Lanzhen，LIU Yi，YANG Dan.The Preparation and performanceof the sponge of chitosan-gelatin[J].Pharmaceutical Biotechnology，2006，13（1）：45-48.（in Chinese）

[19]American National Standards Institute.ASTM E96-00.Standard test methods for water vapor transmission of materials[S]. Philadelphia：ASTM，2000.

[20]中華人民共和國國家質監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 20944.1-2007紡織品抗菌性能的評價第1部分：瓊脂擴散法[S].北京：中國標準出版社，2007.

[21]LU Z，MENG M，JIANG Y.UV-assisted in situ synthesis of silver nanoparticles on silk fibers for antibacterial applications[J]. Colloidsand Surfaces A：Physicochemical and Engineering Aspects，2014，447：1-7.

[22]RAI M，YADAV A，GADE A.Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials[J].Biotechnology Advances，2009，27（1）：76-83.

Preparation and Characterization of Nano-Silver Loaded Fibroin/Alginate Sponge

CHEN Yong， ZHAO Peng， DENG Chao， CHEN Jinghua*
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

This study aimed to fabricate a novel Ag nano-particles（AgNPs）loaded biologic dressing based on silk fibroin（SF）and sodium alginate（SA）.AgNPs were first synthesized in the stabilizer，SF solution，under UV irradiation，and after the addition of SA，were then treated by CaCl2/ethanol /water（molar ratio，1∶71∶77）for 3 h.After rinsing and freeze-drying，AgNPs loaded SF/SA composite sponge（AgNPs-SF/SA）was obtained.Transmission electron microscopy observation（TEM）showed that AgNPs were evenly distributed in the SF solution with a mean diameter of 5.03 nm.Scanning electron microscopy（SEM）images showed that compared with pure SF sponge，AgNPs-SF/SA had a linked porous structure.Addition of SA improved the water absorption and retention ability of the sponge and the synergistic effect of SF and SA increased the water vaportransmission rate.K-B disk diffusion and bacterial solution culture methods indicated that AgNPs-SF/SA possessed a higher and more continuous anti-bacterial potential than the positive control，AQUACEL?Ag，against P.aeruginosa and S.aureus.In conclusion，the excellent physical and anti-bacterial properties demonstrated that AgNPs-SF/SA could be a novel anti-bacterial biologic dressing for prevention and treatment of wound infection.

biologic dressing，anti-bacteria potential，silk fibroin，alginate，nano-silver

R 318.08

A

1673—1689（2017）02—0200—07

2015-02-08

江蘇省產學研聯合創新資金-前瞻性聯合研究項目（BY2014023-170）。

*通信作者：陳敬華（1971—），男，湖北黃石人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事生物大分子和生物功能材料的研究。

E-mail：jhchenwhut@126.com

陳雍，趙朋，鄧超，等.載納米銀絲蛋白/海藻酸鈉海綿的制備及表征[J].食品與生物技術學報，2017，36（02）：200-206.