生物酶法降解煙梗末中果膠的研究

許春平， 劉遠上， 郝 輝， 王文領， 孫斯文，馬宇平*

（1.鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002；2.河南中煙工業有限責任公司技術中心，河南 鄭州450016；3.河南卷煙工業煙草薄片有限公司，河南 許昌461100）

生物酶法降解煙梗末中果膠的研究

許春平1， 劉遠上1， 郝 輝2， 王文領3， 孫斯文1，馬宇平*2

（1.鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002；2.河南中煙工業有限責任公司技術中心，河南 鄭州450016；3.河南卷煙工業煙草薄片有限公司，河南 許昌461100）

通過青霉產果膠酶降低煙梗末中的果膠的含量，從而提高梗末作為原料薄片工藝中的使用性能。首先通過正交實驗確定了酶解的最佳條件為加酶質量分數6%，料液比1 g∶3 mL，酶解溫度50℃，酶解時間2 h，果膠酶的最大降解率為38.92%。然后經熱重分析表明，梗末經果膠酶降解后，最后的殘重從24.46%下降至9.84%，說明酶解后的梗末的燃燒性得到提升。最后，利用熱裂解-氣相色譜/質譜聯用分析酶解前后梗末的熱裂解產物，發現酶解后裂解產中的乙酸含量降低，香味物質吡咯含量升高，這將有助于改善煙草薄片的吸食口感，本研究中為提高造紙法煙草薄片的品質提供了一個新的方法。

果膠降解；生物酶法；煙草薄片；果膠酶

煙草薄片是以廢棄的煙梗、煙末、煙片等煙草質原料，通過物理和化學方法經重組制成煙葉的薄片。造紙法煙草薄片以其密度小、填充值高、柔韌性和耐加工性好、焦油釋放量低、可塑性強的特點，因此，造紙法成為目前國內外生產煙草薄片的主要方法[1]。有研究表明，在卷煙中添加煙草薄片能夠減少卷煙的焦油含量[2]，所以在卷煙中添加薄片絲成為卷煙降焦減害的一項重要手段。造紙法煙草薄片生產主要分為三個過程：萃取濃縮、制漿抄造、涂布干燥[3]，在這個過程中能夠實現人為地調控煙草薄片的物理化學性質。

果膠是煙草及其他植物細胞壁的組成成分之一，是一類比較復雜的多糖，主要由D-半乳糖醛酸和D-半乳糖醛酸甲酯以α-1，4苷鍵連成的直鏈[4]。果膠在煙草制品中的含量為5%～13%[5]。閆克玉等[6]研究表明，果膠含量隨著煙葉部位的升高、顏色的加深、成熟度的提高、厚度的增加而增加，隨等級的降低而降低。果膠質是親水膠體，對煙葉的吸濕性和彈性起一定作用，但果膠質對煙草品質不利，分解會產生甲醇[4]。另外，果膠在煙葉醇化過程中產生多達1.2%～1.5%的乙酸，會產生嗆咳、辛辣灼燒等刺激性氣味，對吸食健康不利[7]。去除煙草制品中的果膠逐漸受到行業研究人員的重視。曹茜等[8]用超聲波輔助法以草酸銨為浸提液去除煙梗中的果膠，去除率達到13.7%。而利用生物產酶法降解果膠的方法比較少。由于梗末呈粉末狀便于利用生物酶法處理，所以本實驗中以青霉菌產果膠酶來降解造紙法薄片生產線上的二號擠干機出口梗末中的果膠，然后對其清除果膠效果進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

二號擠干機出口的梗末，由河南中煙工業有限責任公司提供。

無水乙醇，天津市風船化學試劑有限公司產品；濃硫酸，鹽酸，2 mol/L NaOH，開封市芳晶化學試劑有限公司產品；果膠粉，上海華興化工有限公司產品；D-半乳糖醛酸標準品 （97%），Sigma-Aldrich公司產品；0.15%咔唑溶液，天津市光復精細化工研究所提供等。

BS200S型電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司產品；UV-17001C型紫外分光光度計，上海鳳凰光學科儀有限公司產品；HH-4型電熱數字恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司產品；DSX-280A型不銹鋼手提式滅菌鍋，上海申安醫療器械廠產品；熱重分析儀，美國TA公司產品；CDS PYROPROBE 2000型裂解儀，上海光譜儀器有限公司產品等。

1.2 試驗方法

1.2.1 果膠酶的獲得 果膠酶來自作者所在實驗室優化出的微紫青霉（Penicillium janthinellum）sw09產出的果膠酶，即深層液體發酵培養3 d，離心去除菌絲體，發酵液再經過超濾濃縮，冷凍干燥成酶粉，酶活力經測定約為20 000 U/g，4℃儲存備用。液體深層發酵培養基：葡萄糖50 g/L，酵母浸粉3 g/L，KH2PO41 g/L，果膠粉2 g/L；pH 5。

1.2.2 梗末中果膠含量的檢測 根據楊海健[9]優化的咔唑比色法作為測定梗末果膠含量的方法。其原理是果膠降解生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸與咔唑產生顯色反應，其含量在一定范圍內與其吸光度呈線性關系，繪制半乳糖醛酸標準曲線得到方程：y= 0.008 8x+0.009 8，R2=0.999 1。根據與標準曲線對比測定出梗末酶解前后的果膠含量。

1.2.3 單因素實驗考查各因素對果膠酶降解果膠效果的影響 將梗末烘干，粉碎，取10 g梗末，加水設置不同的料液比（1 g∶1 mL、1 g∶3 mL、1 g∶5 mL、1 g∶7 mL、1 g∶9 mL），加入果膠酶0.5 g，40℃下酶解2 h，按下式（1）計算測定果膠降解率，根據結果確定最適料液比。然后根據得出的最適料液比，設置不同的果膠酶加入量（質量分數1%、2%、3%、4%、5%、6%），40℃下酶解2 h，得出最適的酶液加入量。由得出的最適料液比和果膠酶加入量，設置不同的酶解溫度（30、35、40、45、50、55℃），酶解2 h，得出最適的酶解溫度，相同方法得出最適的酶解時間。

（1）式中R為果膠降解率；W1為酶解前煙梗末中果膠質量；W2為酶解后煙梗末中果膠質量。

1.2.4 正交實驗優化果膠酶降解梗末果膠的條件根據單因素實驗得出的條件設置不同的水平，以果膠降解率為評價標準，選用L9（34）正交表對果膠酶降解梗末果膠的實驗條件進行優化。因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Table of the orthogonal factor levels

1.2.5 梗末的熱重分析 用果膠酶降解梗末，用熱重分析儀分析煙梗末熱重變化，并設置空白對照組。溫度從室溫以10℃/min的速度上升至900℃。

1.2.6 果膠酶降解梗末果膠對其熱裂解產物的影響 利用熱裂解模擬煙草梗末在卷煙中燃燒的情況，并對其裂解產物進行分析。根據賀磊[10]等的研究，煙草薄片在600℃就發生了熱分解。另外，周順[11]等的研究結果指出果膠在無氧環境下的熱解溫度為121℃。綜合考慮，這次實驗的熱裂解溫度設置為600℃，并進行3次重復實驗。

2 結果與討論

2.1 煙梗末中果膠酶解工藝的優化

2.1.1 單因素優化實驗 加酶量、酶解時間、料液比、酶解溫度對果膠酶降解梗末中果膠的影響結果見圖1?？芍z的降解率在一定范圍內隨加酶量的增加而增大，在加酶質量分數達到4%以后果膠的降解率已經上升不明顯，所以，確定最適加酶質量分數為4%。酶解時間越長果膠酶降解越充分，加酶質量分數為4%時，酶解2 h后果膠降解率已不在上升，這可能與酶的活力和用量有關。其他條件一定，料液比在1 g∶3 mL時，有最大的降解率，這是因為料液比太小酶無法與之充分混合，料液比太大會使酶的濃度太低，都會影響果膠的降解。酶都會有其最適反應溫度，當溫度為50℃時，果膠的降解率達到最高，說明此溫度下酶的活力最好。

圖1 4種單因素對果膠降解的影響Fig.1 Effect of four variables on pectin degradation

2.1.2 正交優化實驗 根據單因素時間得出的加酶量、酶解時間、料液比、酶解溫度最適條件，設計水平因素，用L9（34）表對果膠酶降解梗末中果膠的條件進行優化，結果見表2。

表2 青霉產果膠酶降解梗末果膠的正交試驗Table 2 Orthogonal test of tobacco stem end pectin degradation by pectinase from P.janthinellum

續表2

進行極差分析可知，四種因素對果膠酶降解率的影響順序為：加酶量＞酶解溫度＞料液比＞酶解時間。得出的最優條件組合為A3B2C3D1，即加酶質量分數6%，料液比1 g∶3 mL，酶解溫度50℃，酶解時間2 h，該條件下果膠的降解率最高達到38.92%。

2.1.3 熱失重實驗 將梗末在最優條件下酶處理，抽濾烘干，粉碎，取粉末用熱重分析儀分析，空白組用蒸餾水處理，其他條件與加酶實驗組一致。結果見圖2。

圖2 梗末酶解前后的熱重對比分析Fig.2 Thermogravimetric comparison of stem end before and after enzymatic hydrolysis

分析可知，加酶組和空白組加熱失重趨勢基本一致，加酶組和空白組梗末在347.6℃和325.6℃失重速率最大。根據周順[11]等的研究，果膠較纖維素和淀粉的燃燒能力較差，而空白組最后的殘重為24.46%，加酶組經降解果膠后的殘重為9.84%，與之實驗結果相符，也就證明了梗末經青霉產酶降解果膠后燃燒性得到了提升。

2.1.4 梗末的熱裂解實驗 取適量的梗末，在正交實驗得出的最優條件下（加酶質量分數6%，料液比1 g∶3 mL，酶解溫度50℃，酶解時間2 h）處理，抽濾，蒸餾水沖洗兩次，烘干，再次粉碎后，制樣，上熱裂解-氣相色譜/質譜聯用儀（PY-GC/MS）分析其裂解產物。對照組用等量的蒸餾水處理，其他條件與實驗組一致。每組實驗設置3次平行實驗，得出數據取平均值，并對匹配度大于80%的物質進行分析，結果見表3。分析可知，酶解前后梗末熱裂解產物的種類和含量并無明顯差異，有明顯差異的主要集中在小分子范圍，其中丙醇、乙酸質量分數明顯下降，丁烷、羥基丙酮、甲基吡咯質量分數有明顯上升。果膠熱裂解后會產生乙酸[7]，因此果膠質量分數過多會增加煙草危害，而用青霉所產果膠酶處理后，梗末熱裂解產物中乙酸質量分數明顯降低，這是果膠酶能加速梗末內果膠降解，果膠質量分數降低所導致的。另外，梗末經酶處理后，酚類物質如苯酚、間甲酚、2-乙基-5-甲基苯酚質量分數酶解后含量有明顯提高。而烯烴類物質，如4-環戊烯-1，3-二酮、2，5-二甲基-2，4-己二烯、苯乙烯、2，4-二甲基苯乙烯、3-甲基吲哚則明顯減少。新增加的物質有吡咯、2-乙酰基呋喃、1，3-二甲基-1-環己烯、4-甲基愈創木酚、正癸烯，其中吡咯質量分數較多，而吡咯具有甜果香味，有助于增加卷煙的香味。

表3 梗末酶解前后熱裂解產物對比Table 3 Pyrolysis products of stem end before and after enzymatic hydrolysis

續表3

3 結語

本課題試驗中用青霉產果膠酶降解梗末中的果膠，通過單因素和正交實驗優化了果膠酶酶解的最佳條件，使得梗末中的果膠降解率達到38.92%。此外，實驗中還進行了熱重和熱裂解實驗，證明了梗末經青霉產酶果膠酶酶解果膠后，燃燒性能得到提升，而且酶解后梗末在燃燒后，產物中乙酸的含量下降，吡咯等香味植物增加，這有利用提高煙草薄片的吸食口感。綜上所述，利用青霉產果膠酶降解梗末果膠，方法簡單，操作簡單，而且能夠有效降低梗末中的果膠，提高煙草薄片的品質，有很好的工業化應用前景。

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Enzymatic Degradation of Pectin in Tobacco Stem End

XU Chunping1， LIU Yuanshang1， HAO Hui2， WANG Wenling3， SUN Siwen1， MA Yuping*2
（1.College of Food and Biology Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China；2.Technical Center of China Tobacco Henan Industrial Co.Ltd，Zhengzhou 450016，China；3.Henan Cigarette Industry Tobacco Sheet Co.Ltd，Xuchang 461100，China）

This study aimed to degrade the pectin in the tobacco stem end by pectinase from Penicillium and improve its usability as raw material for the reconstituted tobacco.Optimal degradation parameters obtained by the orthogonal method were enzyme dosage 0.6 g，solid/liquid ratio 1∶3，reaction temperature 50℃and time 2 h，which resulted in a maximum degradation rate of 38.51%.Thermogravimetric analysis showed that the residual weight of tobacco stem end was decreased from 24.46%to 9.84%after enzymolysis，indicating that its burning capacity was improved.Pyrolysis-GC/MS analysis found that the content of acetic acid in the smoke was decreased and pyrrole was increased，which would benefit the smoke taste.This study provided a new method to improve the quality of reconstituted tobacco.

pectin degradation，biological enzyme method，reconstituted tobacco，pectinase

S 572；Q 539+.8

A

1673—1689（2017）02—0194—06

2015-04-22

河南中煙科技有限責任有限公司科研項目。

許春平（1977—），男，河南焦作人，工學博士，教授，碩士研究生導師，主要從事生物催化與煙草工程研究。

E-mail：xuchunping05@163.com

*通信作者：馬宇平（1965—），男，河南許昌人，工學碩士，研究員，主要從事煙草產品開發和煙草化學的研究。E-mail：mayp@mail.dihao.cn

許春平，劉遠上，郝輝，等.生物酶法降解煙梗末中果膠的研究[J].食品與生物技術學報，2017，36（02）：194-199.