混合碳源對靈芝多糖發酵及其抗腫瘤活性的影響

李 潔， 丁重陽*， 顧正華， 張 梁， 石貴陽

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫214122）

混合碳源對靈芝多糖發酵及其抗腫瘤活性的影響

李 潔1，2， 丁重陽*1，2， 顧正華1，2， 張 梁1，2， 石貴陽2

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫214122）

為了高效生產活性靈芝多糖，以葡萄糖液體發酵的基本碳源，同時添加兩種靈芝多糖的主要單糖組分——半乳糖和甘露糖，研究混合碳源對靈芝生長、多糖合成及其抗腫瘤活性的影響。結果表明，以不同的混合碳源作為靈芝液態發酵的碳源，發現不同比例的單糖碳源對靈芝多糖產量和生物量影響較小。不同的靈芝多糖劑量對皮膚基底癌細胞A431和人乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖均有抑制作用，碳源比例對靈芝多糖活性影響較大。葡萄糖和半乳糖以質量濃度比1∶1作碳源時抑制率可達到50%～60%；葡萄糖和半乳糖質量濃度比1∶2作碳源時抑制率可達到75%～85%；葡萄糖和甘露糖質量濃度比1∶1作碳源時抑制率可達到60%～65%；葡萄糖和甘露糖質量濃度比1∶2作碳源時抑制率可達到80%～85%；葡萄糖、半乳糖和甘露糖質量濃度比1∶1∶1作碳源時抑制率可達到80%～85%。初始培養基中半乳糖和甘露糖所占比例大有利于靈芝多糖抗腫瘤活性的發揮。

靈芝；靈芝多糖；抗腫瘤活性

靈芝（Ganoderma lucidum）是擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌[1]，在古代靈芝被尊稱為神芝、仙草，是具有營養保健和藥用價值的大型擔子菌之一。近年來隨著人們生活品質的提升，利用食藥用真菌的保健作用越來越受到關注，而靈芝是較早進行相關研究的食藥用真菌。靈芝中含有多種具有生物活性的物質，其中靈芝胞外多糖（Exopolysaccharides）是靈芝中最主要的有效活性物質之一。1948年，Humfeld等人首次利用液態發酵技術培養蕈菌（Agaricus camPestris），率先提出了用液體發酵技術培養菌絲體[2]。經過多年液態發酵技術的發展，目前關于靈芝液態發酵條件對產物合成和菌體生長的影響已有較多研究，培養基組成中碳源對靈芝多糖的影響尤為明顯。從多糖到二糖再到單糖有關靈芝碳源的研究有很多。Degeest等[3]在研究多種碳源對嗜熱鏈球菌多糖產量的影響時，發現葡萄糖和乳糖有利于菌體代謝和多糖合成，加入半乳糖不利于多糖產量積累。Hsieh等人的研究結果也表明，以葡萄糖作為碳源時，靈芝胞外多糖產量隨著葡萄糖濃度升高而升高[4]。靈芝多糖作為靈芝的主要活性物質，具有調節免疫[5]、抗氧化作用[6]、抗腫瘤作用[7]、抗衰老等作用，但目前對靈芝多糖的研究多集中在提高多糖產量、分析多糖結構[8-9]等，較少關注發酵條件尤其是培養基組成對其生物活性的影響。本文中通過改變培養基中碳源的組成，以不同單糖組成為混合碳源考察其對靈芝菌體生長、胞外多糖合成及其抗腫瘤活性的影響，以期利用外源條件調控多糖的性質與生物活性，為高活性多糖的發酵生產提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和試劑 靈芝（G.lucidum）菌株，由江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室保藏；皮膚基底癌細胞A431和人乳腺癌細胞MDA-MB-231，由江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室保藏。

無氨基酵母氮源（YNB），購自拜爾迪公司；胰蛋白胨（Tryptone），購自英國Oxoid公司；胎牛血清（FBS），胰蛋白酶，DMEM液體培養液，美國Hyclone公司產品；雙抗（1×penicillin/streptomycin），購自美國Gibco公司；其它試劑均為國產。

1.1.2 培養基

1）PDA斜面培養基 （g/L）：土豆200，葡萄糖20，瓊脂條20～22。

2）種子和發酵培養基（g/L）：碳源20，胰蛋白胨5，無氨基酵母5，KH2PO43，MgSO4·7H2O2；pH 6.0，種子及發酵培養基滅菌條件為110℃滅菌20 min，碳源單獨滅菌后加入培養基。

3）DMEM完全培養基：DMEM培養液，其中含有體積分數10%的胎牛血清與體積分數1%的雙抗。

1.1.3 儀器和設備 SHI-D型循環水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠產品；HYG-C型旋轉式搖床，太倉市強樂實驗設備有限公司產品；SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州安泰凈化設備有限公司產品；全自動高壓蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司產品；SDX-808型恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠產品；冷凍干燥機，美國Labconco公司產品；顯微鏡，順宇光學科技公司產品；iMarkTM型酶標儀，美國Bio-Rad公司產品；HH-6型數顯恒溫水浴鍋，金壇榮華儀器制造有限公司產品；MCO-18AIC型細胞培養箱，日本SANYO公司產品。

1.2 方法

1.2.1 液體發酵培養 種子培養時，往250 mL的三角瓶里加入80 mL的種子培養基，高壓滅菌，待培養基冷卻后，從菌種斜面中取4塊0.5 cm2大小的活化菌種接入三角瓶內，在150 r/min、30℃條件下培養10 d。發酵培養時，往含有150 mL發酵培養基的500 mL的三角瓶中加入種子，接種量為2 mL菌體勻漿，在150 r/min、30℃條件下培養10 d。

1.2.2 離子色譜測定碳源消耗速率

1）色譜條件：色譜柱CarboPac PA20陰離子交換柱，包括分析柱（2 mm×200 mm）和保護柱（2 mm× 50 mm）。

2）淋洗條件：采用梯度洗脫流速，以250 mmol/L NaOH和CH3COONa為淋洗液進行梯度洗脫，體積流量為0.5 mL/min。

回歸模型通過響應面法得到最優山羊發酵乳產肽工藝條件為菌種添加量4.31%，后熟時間10.99 h，發酵時間9.54 h。考慮實際操作情況與設備參數狀況，確定山羊發酵乳產肽工藝條件為：菌種添加量4%，后熟時間11 h，發酵時間9.5 h，山羊發酵乳水解度預測值8.69%。在上述最佳條件下進行驗證實驗，得到山羊發酵乳水解度平均值9.43%，與理論值接近。

3）檢測器：脈沖安培檢測器。

1.2.3 體外腫瘤細胞生長抑制分析

1）培養細胞：本試驗中選取皮膚基底癌細胞A431和人乳腺癌細胞MDA-MB-231兩株細胞，用DMEM完全培養基培養，在體積分數5%CO2、37℃細胞培養箱中培養至細胞貼壁率達80%，然后用胰蛋白酶消化配制成每毫升培養基中含有4×104個細胞濃度的細胞懸浮液。

2）鋪板：以每孔100 μL細胞懸浮液的量加入到96孔板中，空白組中加等體積的DMEM完全培養基。將96孔板置體積分數5%CO2、37℃的培養箱中培養24 h。

3）加樣：將96孔板中原來的培養基除去，分別加入不同劑量的DMEM培養基配制的多糖樣品100 μL，每個樣品設6個復孔。空白組更換新的DMEM培養基。加樣后繼續在37℃、體積分數5% CO2的培養箱中培養一定時間。隨后加入噻唑藍（MTT），繼續于37℃、體積分數5%CO2的培養箱中培養4 h。

4）檢測：移去96孔板中的所有培養基，向每孔內加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，反復吹吸后，在雙波長595 nm（檢測波長）和655 nm（參考波長）酶標儀上測定各孔的吸光值A。按照式（1）計算腫瘤細胞生長抑制率。

其中，P為腫瘤細胞生長抑制率；A0為對照組吸光組；A1為空白組吸光組；A2為實驗組吸光組。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖和半乳糖混合碳源對靈芝生長和多糖合成的影響

營養物質在細胞增殖和代謝產物的生物合成過程中具有重要作用，不同種類及不同質量濃度的碳源均能造成微生物生長和代謝產物產量的差異。在之前研究靈芝液態發酵時發現，以葡萄糖為單一碳源時靈芝合成的多糖中主要單糖為葡萄糖、半乳糖和甘露糖[10]。因此，在葡萄糖為基本碳源的條件下，加入另外兩種靈芝多糖的主要單糖，考察混合碳源對靈芝生長和多糖合成的影響。以不同比例葡萄糖和半乳糖為碳源進行液體發酵后 （見圖1），結果顯示不同比例的葡萄糖和半乳糖對菌體生長和多糖產量的影響基本相同。對菌體生長而言，在經過前兩天的生長適應期后，菌體量從第3天開始加速生長并在第7天平緩增加；對多糖質量濃度的影響為接種后多糖質量濃度會先有小幅下降，然后在第6天質量濃度達到最高，葡萄糖和半乳糖質量濃度比例為1∶1和1∶2時分別為0.51 g/L和0.55 g/L，在達到最高后，多糖質量濃度開始下降，至發酵結束時（第10天）分別為0.17 g/L和0.08 g/L。

圖1 葡萄糖和半乳糖作為碳源對靈芝菌體干重和靈芝多糖產量的影響Fig.1 Effects of different ratios of glucose to galactose as carbon source on G.lucidum biomass and EPS production

由于不同比例的葡萄糖和半乳糖對菌體生長和多糖質量濃度的影響并不具有明顯的差異，因此在發酵過程中對兩種碳源的質量濃度進行了檢測，結果（見圖2）顯示，以葡萄糖和半乳糖為碳源時，兩種碳源質量濃度在不同混合比例中下降速度差別不明顯，說明靈芝對兩種碳源的吸收利用是同時進行，同時半乳糖質量濃度高于葡萄糖時對靈芝菌體量和多糖質量濃度的影響無明顯差異，說明碳源的混合使用不影響靈芝的利用。

圖2 葡萄糖和半乳糖作為碳源發酵過程中碳源的消耗Fig.2 Consumption of glucose and galactose as carbon sources during G.lucidum fermentation

2.2 葡萄糖和甘露糖混合碳源對靈芝生長和多糖合成的影響

以葡萄糖和甘露糖為組合碳源時，靈芝菌體生物量和胞外多糖質量濃度的變化規律見圖3，結果顯示葡萄糖和甘露糖質量濃度比1∶1混合碳源對靈芝生長和胞外多糖質量濃度的影響與葡萄糖和半乳糖混合時相類似，但菌體生物量在發酵前期沒有出現適應期，從開始便呈現遞增趨勢，在發酵結束時菌體生物量分別達到9.35 g/L和8.05 g/L；胞外多糖質量濃度在發酵前期有明顯的下降趨勢，從第3天開始增加到第6天達到最高，葡萄糖和甘露糖質量濃度比例為 1∶1和 1∶2時分別為 0.53 g/L、0.55 g/L。測定發酵過程中葡萄糖和甘露糖的質量濃度時發現，靈芝對這兩種碳源的利用速率基本一致，在發酵過程中葡萄糖和甘露糖都可以得到充分利用（見圖4）。Jeong S K[11]等選取多種碳源其中包括葡萄糖、甘露糖和半乳糖，對蛹蟲草深層發酵，結果發現分別以葡萄糖和甘露糖為碳源時菌體生物量最終積累量和多糖質量濃度基本一樣，以半乳糖為碳源時多糖質量濃度低。這也說明菌體對葡萄糖和甘露糖的吸收和利用水平相當。

圖3 葡萄糖和甘露糖作為碳源對靈芝菌體干重和靈芝多糖產量的影響Fig.3 Effect of glucose and mannose as carbon sources on G.lucidum biomass and EPS yield

圖4 葡萄糖和甘露糖作為碳源發酵過程中碳源的消耗Fig.4 Consumption of glucose and galactose as carbon sources during G.lucidum fermentation

2.3 葡萄糖、半乳糖和甘露糖混合碳源對靈芝生長代謝的影響

葡萄糖、半乳糖和甘露糖質量濃度比為1∶1∶1作為碳源時，靈芝菌體在第5天胞外多糖質量濃度達到最高值0.57 g/L，菌體生物量最高達到9.88 g/L（見圖5）。與葡萄糖和半乳糖、葡萄糖和甘露糖兩種混合方式相比，多糖質量濃度在不同碳源混合發酵過程中并無明顯差異，僅在菌體量方面表現出一定差異。Jonathan等[12]在比較不同碳源（葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、鼠李糖等）對 Psathyerella atroumbonata藥食用真菌生物量的影響時發現，葡萄糖是菌體最喜愛的碳源，其次為甘露糖，半乳糖較差。圖6為葡萄糖、半乳糖和甘露糖質量濃度比1∶1∶1作為碳源發酵過程中碳源的消耗。在發酵過程中，3種碳源的質量濃度基本一直在下降，葡萄糖和甘露糖下降速度相當，半乳糖下降速度較慢。

圖5 葡萄糖、半乳糖和甘露糖（質量濃度比為1∶1∶1）作為碳源對靈芝菌體干質量和靈芝多糖產量的影響Fig.5 Effect of glucose，galactose and mannose（1∶1∶1）as carbon sources on G.lucidum biomass and EPS yield

圖6 葡萄糖、半乳糖和甘露糖（質量濃度比為1∶1∶1）作為碳源發酵過程中碳源的消耗Fig.6 Consumption of glucose，galactose and mannose（1∶1∶1）as carbon sources during G.lucidum fermentation

2.4 靈芝胞外多糖的抗腫瘤活性

近年來對多種真菌多糖的研究發現，多糖在單糖組成、相對分子質量等方面的不同會導致其生物活性也會有所差異[13]。靈芝多糖的單糖構成中，常見的有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、巖藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和阿拉伯糖[14]，而之前的研究中發現本試驗所用的靈芝單糖組分主要為葡萄糖、甘露糖和半乳糖。目前研究碳源對多糖產量的報道較多，但很少有研究關注碳源對靈芝多糖活性影響的報道。本研究中以不同混合碳源條件下獲得的靈芝胞外多糖作為加樣多糖，檢測了不同碳源下獲得的靈芝多糖對皮膚基底癌細胞A431和人乳腺癌細胞MDA-MB-231的抑制率。

選用同一發酵階段不同培養基組合條件下獲得的靈芝多糖作為加樣多糖，使用DMEM完全培養基將其分別配成3個質量濃度梯度。檢測其對皮膚基底癌細胞A431和人乳腺癌細胞MDA-MB-231的抑制率，見圖7。

圖7 不同混合碳源下，獲得的靈芝多糖對A431和MDAMB-231的抑制作用Fig.7 Effects of different carbon sources on anti-tumor activity of G.lucidum EPS against the growth A431 and MDA-MB-231 cells

結果顯示，不同混合碳源條件下得到的多糖在不同質量濃度中對兩種腫瘤細胞生長的抑制率顯現出明顯差異，其中在葡萄糖與半乳糖和甘露糖分別以質量濃度比1∶2和1∶1∶1比例混合下獲得的多糖活性最高，同時隨著多糖質量濃度的增加對兩種腫瘤細胞生長的抑制率都有明顯的增加，在2 g/L質量濃度下兩種腫瘤細胞生長的抑制率可以達到80%左右。Lee等[15]也曾報道培養基碳源種類不同對P.linteus的多糖的活性的影響較大，當以甘露糖或淀粉為碳源時，獲得的多糖的免疫調節活性要比葡萄糖作為碳源時多糖的活性高出1.5倍。喬等[16]在研究液體發酵條件對靈芝菌體形態及胞外多糖活性的影響時發現pH、培養溫度、轉速對靈芝多糖抗腫瘤活性都會產生影響。Peng[17]等研究發現，含有一定比例的半乳糖及蛋白質的靈芝多糖擁有較高的抗腫瘤活性。本實驗的研究結果也表明，培養基中半乳糖和甘露糖所占比例高有益于靈芝多糖抗腫瘤活性的發揮。半乳糖和甘露糖的加入提高了靈芝多糖的抗腫瘤活性。

3 結語

近年來，隨著對靈芝研究的不斷深入，靈芝多糖的合成和生物活性已引起生物化學領域和醫藥界的普遍關注。Yang[18]發現向培養基中添加植物油能夠刺激靈芝的菌體生長及多糖的積累。Tang等[19]在研究培養條件對靈芝多糖和靈芝酸產量的影響時，發現乳糖有利于靈芝菌體生長，而蔗糖有利于靈芝多糖產量的提高。作者通過控制培養基碳源組合和比例，研究了菌體對培養基初始碳源的利用率和不同碳源組合對靈芝多糖質量濃度和菌體生物量的影響，并且研究了不同培養基組合條件下獲得的靈芝多糖對皮膚基底癌細胞A431和人乳腺癌細胞MDA-MB-231的抗腫瘤活性。雖然混合碳源對靈芝多糖質量濃度沒有影響，但是對多糖的生物活性產生了影響，培養基中半乳糖和甘露糖所占比例高有益于靈芝多糖抗腫瘤活性的發揮。因此，在今后的研究中不能只關注多糖質量濃度的提高，如何生產出穩定的高活性的多糖才是最主要的目標。

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Effects of Mixed Carbon Sources on Production and Antitumor Activity of Ganoderma lucidum Exopolysaccharides by Submerged Culture

LI Jie1，2， DING Zhongyang*1，2， GU Zhenghua1，2， ZHANG Liang1，2， SHI Guiyang2
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To enhance production and activity of G.lucidum exopolysaccharides（EPS），a mixed carbon source containing glucose，galactose and mannose was applied and effects of mixed carbon sources on cell growth，EPS composition and antitumor activity were studied.Results showed that dry cell weight and EPS production were slightly affected by the ratio and type of monosaccharides. Anti-tumor activity analysis of G.lucidum EPS indicated that the raise of EPS concentration increased its biological activity.The inhibition reached up to 50%～60%with the ratio of glucose to galactose 1∶1 as carbon source，75%～85%with the ratio of glucose to galactose 1∶2，60%～65%withthe ratio of glucose to mannose 1∶1，80%～85%with the ratio of glucose to mannose 1∶2 and 80%～85%with the same concentrations for three monosaccharides.The high ratio of galactose or mannose in culture medium was beneficial to the anti-tumor activity of EPS against the growth of A431and MDA-MB-231 cells.

Ganoderma lucidum，exopolysaccharides，anti-tumor activity

TQ 281

A

1673—1689（2017）02—0129—07

2015-04-17

國家自然科學基金項目 （31271918）；國家863計劃項目 （2012AA021505）；中央高校基本科研業務費專項資金項目（JUSRP51319B）。

*通信作者：丁重陽（1975—），男，江蘇南通人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事發酵過程優化控制及食藥用真菌生物技術研究。E-mail：zyding@jiangnan.edu.cn

李潔，丁重陽，顧正華，等.混合碳源對靈芝多糖發酵及其抗腫瘤活性的影響[J].食品與生物技術學報，2017，36（02）：129-135.