連作三七根際土壤化感物質(zhì)檢測及其提取液對三種作物種子萌發(fā)的影響

摘要：【目的】探討連作三七根際土壤中化感物質(zhì)的種類及土壤浸提液對不同作物種子萌發(fā)的影響，為揭示連作三七根際土壤的化感作用機理提供理論依據(jù)。【方法】采用高效液相色譜分析（HPLC）測定未種植過三七的生土及種植1年、2年和3年三七的根際土壤中化感物質(zhì)的種類及相對含量，并采用生物測定方法檢測不同土壤浸提液對當?shù)爻Ｒ姶筇镒魑镉筒恕⒂衩缀桶撞朔N子萌發(fā)的影響。【結(jié)果】不同種植年限三七根際土壤中均檢測到酚酸類化合物，隨著種植年限的增加，除肉桂酸外，多數(shù)酚酸類化合物的含量（通過峰面積判斷）較生土呈下降趨勢，但無明顯變化規(guī)律。同一種植年限下，較生土而言，隨著土壤水提液濃度的增大，3種作物種子的萌發(fā)率整體上呈升高趨勢；同一土壤水提液濃度處理下，種植3年三七的根際土壤水提取液對3種作物種子萌發(fā)的促進作用明顯高于其他年限根際土壤水提液。不同溶劑土壤提取液處理下，隨著土壤提取液濃度的提高，3種作物發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)逐漸表現(xiàn)出差異，多隨著提取液濃度的增加，表現(xiàn)出促進作用。【結(jié)論】三七連作土壤中的大多數(shù)酚酸類化合物可能不是主要的化感物質(zhì)，其土壤提取液對部分作物種子的萌發(fā)表現(xiàn)出濃度依賴性。

關(guān)鍵詞： 三七；連作土壤提取液；化感作用；種子萌發(fā)

中圖分類號： S567.236 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）07-1178-07

0 引言

【研究意義】植物的化感作用（Allelopathy）是指供體植物產(chǎn)生并通過揮發(fā)、淋溶、分泌和分解等方式向環(huán)境釋放某些化學物質(zhì)，影響周圍受體植物生長及發(fā)育的化學生態(tài)學現(xiàn)象（拱健婷等，2015），其中根系分泌物是化感作用的主要來源（呂豐娟等，2016）。化感作用是連作障礙現(xiàn)象產(chǎn)生的主要因素之一，多種藥用植物如人參（Panax ginseng C. A. Mey.）（黃小芳等，2009；龍期良等，2016）、西洋參（P. quinquefolius L.）（楊家學，2009；焦曉林等，2015）、三葉青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）（周武等，2015）和地黃[Rehmannia glutinosa（Gaetn.） Libosch. ex Fisch. et Mey]（黃錦鵬等，2016）等均存在顯著的化感作用。化感作用在藥用植物三七[P. notoginseng（Burk） F.H.Chen.]的農(nóng)業(yè)種植過程中也較常見（吳立潔等，2014；拱健婷等，2014，2015；孫雪婷等，2015；Sunaina and Singh，2015），且化感效應的產(chǎn)生嚴重影響三七的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，探討連作三七根際土壤中化感物質(zhì)的種類及土壤浸提液對作物種子萌發(fā)的影響，對克服三七栽培過程中產(chǎn)生的連作障礙具有重要意義。【前人研究進展】近年來，已有學者對藥用植物的化感作用開展了較多研究工作。Nicol等（2002）、楊家學和高薇薇（2009）測定了不同濃度羥基苯甲酸、香豆酸等對西洋參根長的影響，結(jié)果顯示兩種物質(zhì)均對西洋參根長表現(xiàn)出抑制作用。張亮等（2015）、沈玉聰?shù)龋?016）的研究結(jié)果表明，5種酚酸類物質(zhì)對三七幼苗生長均有一定的化感抑制作用。在三七的化感作用及其與連作障礙的關(guān)系方面，游佩進等（2009b）、張子龍等（2015）通過對連作三七土壤進行分析，發(fā)現(xiàn)土壤中含有三七皂苷R1，并推測其可能是導致三七連作土壤水浸提液具有化感抑制作用的物質(zhì)基礎(chǔ)；吳立潔等（2014）用HPLC-MS方法確定在三七根際土壤中存在香草酸、對羥基苯甲酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸和苯甲酸等6種酚酸類成分；許彥國等（2015）也利用HPLC-MS從三七連作土壤中鑒定出7種皂苷，證明其可顯著降低三七種子出苗率和存苗率。【本研究切入點】目前，探討三七根際土壤自毒物質(zhì)及其生物活性的研究相對較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過高效液相色譜分析（HPLC）測定未種植過三七的生土和三七連作土壤中常見的酚酸類化感物質(zhì)，初步分析連作三七根際土壤中主要的化感物質(zhì)，并測定其不同濃度土壤提取液對常見大田作物種子萌發(fā)的影響，為進一步揭示連作三七根際土壤的化感作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗地概況

供試土壤采集于云南省文山州硯山縣。硯山縣位于云南省東南部，東經(jīng)103°35′～104°45′、北緯23°18′～

23°59′，海拔1539 m，屬低緯北亞熱帶高原季風氣候，年平均氣溫16.1 ℃，正常年降水量1008 mm，全年無霜期250～320 d，是三七的傳統(tǒng)主產(chǎn)區(qū)之一。選擇處于相鄰位置的生土及種植1年、2年和3年三七的地塊進行取樣，各地塊土壤類型基本一致。每份土樣均根據(jù)五點取樣法取得。

1. 2 試驗材料

生物活性供試材料為油菜（Brassica chinensis L.）超級油王、玉米（Zea mays L.）白糯一號和白菜（B. campestris L.）紅圣白二號，均購自云南省農(nóng)業(yè)科學院種子公司。油菜、玉米和白菜是文山地區(qū)三七種植采收后的常種作物，且已有較多研究表明這3種作物對化感作用較敏感，常作為化感受體材料（游佩進等，2009a；張敏等，2010；張子龍等，2014）。因此，本研究選用這3種作物作為供試材料；同時，三七根際土壤化感物質(zhì)的自毒效應已明確（許彥國等，2015），試驗不再選擇三七材料進行重復驗證。

1. 3 試驗方法

試驗于2016年5～8月進行。采用生物活性測定的方法，將不同種植年限三七的土壤樣品稀釋成10%、20%、30%、40%和50%共5個濃度水平。提取溶劑分別為純水和甲醇。以生土提取液為對照，每處理5個重復。采用室內(nèi)培養(yǎng)，試驗盆缽用培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿墊兩層濾紙，注入10 mL提取液。玉米種子和白菜種子播種后5 d統(tǒng)計發(fā)芽勢，油菜種子播種后3 d統(tǒng)計發(fā)芽勢。室內(nèi)試驗在西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心進行。

1. 4 測定項目及方法

1. 4. 1 土壤樣品自毒物質(zhì)檢測方法 將土壤樣品自然風干，過40目篩，稱取200 g置于500 mL具塞三角瓶中，加入250 mL 80% NaOH溶液，置于搖床上，140 r/min振蕩提取24 h，中速定量濾紙過濾（為保證過濾完全，對剩余土壤提取液進行離心，提取上清液，與之前濾液混合）。向上述濾液中添加HCl，調(diào)整其pH至2.5。將調(diào)整完pH的溶液用乙酸乙酯進行萃取，連續(xù)萃取3次后，將萃取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上55 ℃減壓蒸干，用甲醇定容至5 mL，避光，4 ℃保存，待測。

將上述待測液過0.22 mm濾膜，HPLC待測。HPLC色譜條件：儀器為Agilent HPLC 1260 System；色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250.0 mm，5.0 mm）；檢測波長280 nm；流速1 mL/min；進樣量25 μL；柱溫25 ℃；甲醇—水系統(tǒng)，流動相A是甲醇，流動相B是0.01 mol/L磷酸水溶液（pH 2.8）。所用甲醇為色譜純（JT Baker公司生產(chǎn)），共用標準品11個：鄰苯二酚、對羥基苯甲酸、香草酸、兒茶素、丁香酸、香蘭素、對羥基肉桂酸、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸、肉桂酸，標品均購自成都植標化純生物技術(shù)有限公司，HPLC測定純度大于98%。

1. 4. 2 不同種植年限三七根際土壤提取液的制備

將各供試土樣置于室內(nèi)陰干，除去其中殘留的石塊、植物根系等雜物，過2 mm篩。稱取上述土壤200 g，添加蒸餾水300 mL，置于控溫搖床4 ℃、140 r/min搖置24 h。取下過濾，4 ℃低溫保存。將濾液稀釋成10%、20%、30%、40%和50% 5個濃度水平用于白菜、油菜和玉米種子萌發(fā)試驗。

1. 4. 3 三七根際土壤不同溶劑提取液的制備 （1）不同濃度水提液的制備：稱取種植3年的三七根際土壤0（CK）、20、40、60、80和100 g，將其置于500 mL錐形瓶中，添加300 mL蒸餾水，在控溫搖床上搖置24 h（140 r/min，4 ℃）。取下后用中性定性濾紙過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩＃?）不同濃度醇提液的制備：稱取種植3年的三七根際土壤0（CK）、20、40、60、80和100 g，添加300 mL 20%甲醇（分析純），置于控溫搖床上搖置24 h（140 r/min，4 ℃）。取下后用中性定性濾紙過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4. 4 化感作用生物檢定 選取大小一致、健康飽滿的白菜種子50粒，油菜種子50粒，玉米種子15粒。用3%的NaClO溶液表面處理5 min，經(jīng)蒸餾水反復沖洗后均勻播于鋪有兩層滅菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿中。取上述不同種植年限不同濃度水提液，種植3年的三七根際土壤不同濃度純水、甲醇提取液各5 mL，添加至培養(yǎng)皿中，于25 ℃、每日光培養(yǎng)12 h（照度33%），暗培養(yǎng)12 h。同體積的蒸餾水及甲醇處理萌發(fā)的供試種子作為對照。播種后次日開始，每天記錄萌發(fā)的種子數(shù)，連續(xù)觀察10 d，計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽率（%）=發(fā)芽數(shù)/播種種子數(shù)×100

發(fā)芽指數(shù)（GI）=Σ（Gt/Dt）

式中，Gt是t日內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt是相應的發(fā)芽天數(shù)。

發(fā)芽勢（%）=萌發(fā)的種子數(shù)/播種數(shù)×100

1. 5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007和Sigmaplot 10.0進行統(tǒng)計分析和制圖，采用LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同種植年限三七根際土壤酚酸類化感物質(zhì)差異

由表1可知，不同種植年限三七根際土壤中均檢測到酚酸類化合物，且液相檢測結(jié)果顯示，隨著種植年限的增加，除肉桂酸外，多數(shù)酚酸類化合物的峰面積較生土呈下降趨勢，但無明顯變化規(guī)律。其中，生土中檢測到鄰苯二酚、對羥基苯甲酸、香草酸、兒茶素、丁香酸、香蘭素、對羥基肉桂酸、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸和肉桂酸等11種酚酸類化感物質(zhì)；種植1年三七的根際土壤中未檢測到丁香酸和水楊酸，液相色譜檢測到肉桂酸峰面積高于生土；種植2年和3年三七的根際土壤中未檢測到兒茶素和水楊酸，且大部分化合物的峰面積均低于生土。

2. 2 不同種植年限三七根際土壤水提液對3種作物種子發(fā)芽率的影響

因前期預試驗觀察到種植1年三七根際土壤的水提液對作物種子萌發(fā)的影響與生土一致，因此后期試驗僅對生土和種植2年、3年三七的土壤進行分析。由表2可知，同一種植年限下，較生土而言，隨著土壤水提液濃度的增大，3種作物種子的發(fā)芽率整體上呈升高趨勢；同一土壤水提液濃度處理下，種植3年三七的土壤水提取液對種子萌發(fā)的促進作用明顯高于其他年限根際土壤水提液。

2. 3 種植3年三七根際土壤不同溶劑提取液對3種作物種子發(fā)芽率的影響

如圖1-A所示，相同濃度土壤水提液處理下，油菜發(fā)芽率最高，白菜次之，玉米發(fā)芽率最低。隨著土壤水提液濃度的增大，白菜和油菜種子的發(fā)芽率無顯著變化（P>0.05，下同），但玉米種子的發(fā)芽率在不同濃度下變化明顯，土壤水提液濃度為80 g/300 mL時發(fā)芽率最高，濃度為40 g/300 mL時發(fā)芽率最低。表明不同濃度土壤水提取液對白菜和油菜種子發(fā)芽率的抑制作用不明顯，而對玉米種子的發(fā)芽則表現(xiàn)為低濃度抑制、高濃度促進。

如圖1-B所示，不同濃度土壤醇提液處理下，白菜、油菜和玉米種子的發(fā)芽率均表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05，下同）。白菜種子在土壤醇提液濃度為80 g/300 mL時發(fā)芽率最高，CK發(fā)芽率最低；油菜種子在土壤醇提液濃度為80 g/300 mL時發(fā)芽率最高，濃度為60 g/300 mL時發(fā)芽率最低；玉米種子在土壤醇提液濃度為40 g/300 mL時發(fā)芽率最高，濃度為80 g/300 mL時發(fā)芽率最低。

2. 4 三七根際土壤不同溶劑提取液對3種作物發(fā)芽指數(shù)的影響

由表3可知，隨著水提液濃度的增加，白菜種子的發(fā)芽指數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，水提液濃度為60 g/300 mL時發(fā)芽勢最高，為13.661；油菜和玉米種子的發(fā)芽指數(shù)呈現(xiàn)出先升高后降低再升高又有所降低的波動變化，二者均在水提液濃度為80 g/300 mL時達最高值，分別為18.323和2.260。3種作物在不同濃度土壤水提液處理下的發(fā)芽指數(shù)整體上均高于CK，表明土壤水提液對3種作物種子的發(fā)芽有一定促進作用。

種植3年三七根際土壤不同濃度醇提液處理下，3種作物種子的發(fā)芽指數(shù)存在顯著差異。其中白菜種子發(fā)芽指數(shù)在土壤醇提液濃度為80 g/300 mL時最高，CK中最低，說明土壤醇提液對白菜種子發(fā)芽表現(xiàn)為促進作用。油菜種子的發(fā)芽指數(shù)在土壤醇提液80 g/300 mL時最高，土壤醇提液濃度為60 g/300 mL時最低。玉米種子的發(fā)芽指數(shù)在土壤醇提液濃度為40和60 g/300 mL時最高，當濃度為80 g/300 mL時其發(fā)芽指數(shù)為0，表明土壤醇提取液對部分作物種子的萌發(fā)表現(xiàn)出濃度依賴性。

2. 5 三七根際土壤不同溶劑提取液對3種作物發(fā)芽勢的影響

不同濃度三七根際土壤水提液處理下，白菜、油菜、玉米發(fā)芽勢均表現(xiàn)出顯著差異。由圖2-A可看出，不同濃度三七土壤水提液處理下，3種作物的種子發(fā)芽勢無明顯的變化規(guī)律， 除20 g /300 mL土壤水提液處理下白菜種子發(fā)芽勢為10.08%外，其余濃度水提液處理下白菜種子發(fā)芽勢均在50.00%左右；油菜種子發(fā)芽勢在土壤水提液濃度為100 g/300 mL時最高，濃度為20 g/300 mL時最低。玉米種子發(fā)芽勢在CK中最低，土壤水提液濃度為80 g/300 mL時最高。由圖2-B可看出，3種作物的種子發(fā)芽勢在不同濃度三七土壤醇提液處理下同樣無明顯變化規(guī)律，白菜和油菜種子的發(fā)芽勢在土壤醇提液濃度為80 g/300 mL時最高；玉米種子發(fā)芽勢在土壤醇提液濃度為20 g/300 mL時最高，當濃度為80 g/300 mL時其發(fā)芽勢為零。

3 討論

3. 1 連作三七根際土壤化感物質(zhì)的復雜性

吳立潔等（2014）在三七根際土壤中檢測到鄰苯二酚、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素等10種酚酸類物質(zhì)，本研究通過HPLC法，從三七種植土壤中也檢測到鄰苯二酚、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素等8種酚酸類物質(zhì)。通過對峰面積的比較分析發(fā)現(xiàn)，肉桂酸峰面積明顯高于生土。Chen等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，土壤中肉桂酸含量隨著茄子連作年限的增加而增多，茄子枯萎病發(fā)病率也越高，認為高濃度肉桂酸增加了茄子的自毒作用和感病率。依此推測，三七連作土壤中肉桂酸可能為化感自毒物質(zhì)，但還需進一步驗證。相對于生土，種植1年的三七根際土壤中未檢測到丁香酸和水楊酸，種植2年和3年的三七根際土壤中未檢測到兒茶素和水楊酸；且檢測到的大部分化合物其峰面積均低于生土。說明大多數(shù)酚酸類物質(zhì)可能對三七無化感作用。

種植過三七的土壤，由于其藥材生長特性，種植2年和3年的三七地下部分干物質(zhì)積累量12月達全年最大值，且生長3年三七的經(jīng)濟價值最高，成苗移栽后三七需要栽種2年才進行采收，所以栽培過程中土壤理化性狀發(fā)生了很大改變。此外，過度施加農(nóng)藥導致土壤板結(jié)嚴重，透氣性差，也使得土壤的粘結(jié)性更嚴重，酚酸類化合物多為小分子化合物，在這樣的土壤中極易降解。種植三七的根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)單一，很多病原菌的主要能源物質(zhì)即為酚酸類小分子化合物。自然土壤環(huán)境中，在土壤微生物的作用下，這些化感物質(zhì)極易被降解或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。這可能是導致土壤的HPLC檢測結(jié)果中酚酸類化合物峰面積差異較大且無明顯規(guī)律的原因。

3. 2 化感作用與生物活性的相關(guān)性

在研究植物化感作用的過程中，主要通過統(tǒng)計被試種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢和胚根長等指標來進行評估化合物的化感效應。董沁芳（2006）在研究百合（Liliumbrowniivar viridulum）植株水浸液化感效應時發(fā)現(xiàn)，百合各器官水浸液對黃瓜（Cucumis sativus Linn）、番茄（Lycopersicon esculentum Mill）、蘿卜（Raphanus sativus L）和大蔥（Allium fistulosum L. var. giganteum Makino）種子的萌芽和幼苗生長均產(chǎn)生化感作用，且各器官水浸液的化感效應具有特異性及濃度依賴性特征；隨著水提液濃度的增加，受體植物的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)降低。徐建中等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)（Atractylodes macrocephala Koidz.）植株水浸液對其幼苗表現(xiàn)出生長抑制作用，且苗期時抑制作用最強，隨著提取液濃度的增加，其抑制作用增強。這些研究結(jié)果表明酚酸類物質(zhì)的化感效應具有濃度依賴性特征。

本研究觀察了不同種植年限三七根際土壤水提液對白菜、油菜和玉米種子發(fā)芽率的影響，結(jié)果顯示，3種作物種子的萌發(fā)率隨著土壤水提液濃度的增大而升高，隨著土壤水提液濃度的增加，其對白菜和油菜種子的萌發(fā)均表現(xiàn)為促進作用，且隨著土壤種植年限的增加，其促進作用增強；玉米種子對土壤水提液不敏感，無顯著規(guī)律。三七根際土壤不同溶劑提取液對3種作物種子萌發(fā)的試驗結(jié)果顯示，不同濃度土壤醇提液處理下，3種作物的種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢均無明顯規(guī)律，但隨著土壤水提液和醇提液濃度的提高，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)逐漸表現(xiàn)出差異，多隨著提取液濃度的增加，表現(xiàn)出促進作用。游佩進等（2009c）研究表明，連作三七土壤水提液對3種蔬菜種子的萌發(fā)率均無顯著影響，本研究結(jié)果與其存在差異，可能是由于試驗中土壤提取液的濃度不同及不同作物對化感效應的敏感性不同導致。本研究結(jié)果表明，三七根際土壤提取液對部分作物種子萌發(fā)表現(xiàn)出濃度依賴性。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，大部分酚酸類化合物可能不是導致三七化感效應的主要物質(zhì)，但還需要進一步驗證。生物檢測結(jié)果顯示，連作三七根際土壤提取液對部分作物種子的萌發(fā)表現(xiàn)出濃度依賴性。

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（責任編輯 王 暉）