港口航道致病性細菌檢測微陣列基因芯片的研制

摘要：【目的】制備出一套針對港口航道致病性細菌檢測的基因芯片，為港口航道基因芯片檢測技術的研究及應用打下基礎。【方法】采用常規方法提取目標菌株基因組DNA，以16S rDNA通用引物和gyrB基因保守區引物進行PCR擴增，使用AlleleID 6.0和Array Designer 4.25對擴增獲得的目的片段進行寡核苷酸探針設計，經PCR篩選驗證，目標探針以氨基化修飾后通過芯片點樣儀點制在醛基玻片上；優化芯片雜交固定條件，并用于港口航道的水樣檢測，以驗證微陣列基因芯片的檢測效果。【結果】優化后的芯片雜交固定條件為探針點樣濃度10 μmol/L、紫外交聯時間2.0 h、雜交溫度65 ℃，有效提高了基因芯片檢測的靈敏度，與傳統檢測方法相比可實現快速、高通量、準確的目標。研制的微陣列基因芯片可特異性檢測出港口航道中含有的霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、陰溝腸桿菌（Emterobacter cloacae）、溶藻弧菌（V. alginolytivus）、哈氏弧菌（V. harveyi）、副溶血弧菌（V. parahemolyticus）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和創傷弧菌（V. vulnificus）等7株致病性細菌，且均未出現非特異性雜交。【結論】針對港口航道致病性細菌建立的微陣列基因芯片檢測技術具有特異性強、靈敏度高、快速便捷的特點，可用于港口航道及周邊地區的海洋環境監測和海產品質量安全檢測。

關鍵詞： 致病性細菌；港口航道；基因芯片；檢測

中圖分類號： S917.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）07-1304-06

0 引言

【研究意義】作為人類航海活動和貨物進出口的集散地，港口航道及其附近水域的生態狀況對海洋生態環境產生重要影響。港口航道病原菌監測是海洋環境監測的重要內容之一（陳斯婷，2008）。目前，病原菌檢測在醫學上已十分成熟，但在水產養殖、水環境監控等方面尚未實現快速、低成本、高通量等檢測目標，大多數國家仍沿用傳統的細菌培養鑒定方法，檢測周期長、操作繁瑣、靈敏度低，且每次只能檢測出一種致病菌，面對日益增加的多重混合污染，該檢測方法顯得嚴重滯后。基因芯片是近年發展起來的一種高新生物技術，可對多種靶基因同時進行檢測鑒定，憑借其快速、高通量、平行化等特點已得到廣泛應用（陳昱等，2009）。因此，建立一種基于基因芯片技術的多病原菌檢測方法，對加強港口航道病原菌監測及采取有效預防措施具有重要意義。【前人研究進展】1995年，Schena等首次發表了關于基因芯片研究的科技論文；1996年底，Fodor研制出第一塊DNA芯片。隨后，陸續有學者將基因芯片應用于食品致病菌檢測。Call等（2001）報道，采用基因芯片檢測鑒定大腸桿菌O157∶H7不同基因型時，其靈敏度（1 fg）是多重PCR的32倍。González等（2004）研究發現，采用基因芯片檢測海水病原菌的靈敏度也比多重PCR高，可在20 fg以下。此外，基因芯片可解決多重PCR對部分菌株無法進行分型的問題。AI-Khaldi等（2004）、Jung等（2004）均研究表明，采用基因芯片檢測病原菌的靈敏度明顯高于多重PCR，且在菌株分型方面具有更大優勢。在國內，唐曉敏和高志賢（2003）率先將基因芯片檢測技術應用于水體細菌檢測；蔣紅霞等（2004）研制出寡核苷酸芯片用于檢測獸醫病原菌耐藥性；曹三杰等（2009）以S、S3、sM、M、N、ORF7、POL等為靶基因，構建了豬傳染性胃腸炎病毒檢測基因芯片；李晨等（2011）研制出針對3種水產病原菌的簡型基因芯片，并將基因芯片技術推廣到水產領域；朱業培等（2015）以線粒體DNA基因（mtDNA）和細胞色素b基因（cytb）為目標基因，建立了可同時鑒別牛、羊、豬、馬、鹿、兔6種動物源性成分的基因芯片檢測技術，為我國肉及肉制品快速檢測和種屬鑒別提供了技術支持；楊國淋等（2016）將不對稱PCR和基因芯片兩種技術相結合，構建了同步檢測雞傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）的基因芯片。【本研究切入點】目前，基因芯片技術已普遍應用于動植物的生長發育、抗生物和非生物逆境、病蟲害檢測、轉基因農產品檢測、品質和產量形成等研究（肖翔等，2012；薛輝等，2015；蘇寧等，2016），在農業領域取得了巨大成就，但至今尚無運用基因芯片技術檢測上海港口航道致病性細菌的研究報道。【擬解決的關鍵問題】根據分離獲得的港口航道致病性菌株，設計一套特異性引物和探針，優化芯片雜交固定條件，制備出檢測港口航道致病性細菌的基因芯片，為港口航道基因芯片檢測技術的研究及應用打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗菌株是從上海洋山港港口航道分離鑒定獲得的7株致病性菌株，分別為：副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydro-

phila）、霍亂弧菌（V. cholerae）、陰溝腸桿菌（Entero-

bacter cloacae）、哈氏弧菌（V. harveyi）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）和創傷弧菌（V. vulnificus）。光學級醛基基片、芯片雜交盒、芯片蓋片、芯片和蓋片儲存盒、微陣列芯片離心管、雜交Buffer、紫外交聯儀、晶芯Lux Scan 10K微陣列芯片掃描儀等購自北京博奧生物有限公司；細菌基因組抽提試劑盒、Klenow酶及DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司；圓底低容量NBS表面384孔板購自美國Corning公司。

1. 2 含特異性探針的目的片段擴增

16S rDNA通用引物（27F-1492R）和gyrB基因保守區引物（gyrB-F：5'-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHG

G-3'，gyrB-R：5'-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3'）由上海杰李生物技術有限公司合成。以試劑盒提取目標菌株基因組DNA后，采用以上引物進行PCR擴增，以期獲得含特異性探針的目的片段。

1. 3 探針設計與合成

使用AlleleID 6.0和Array Designer 4.25對上述擴增獲得的目的片段進行寡核苷酸探針設計。選擇特異性高、引物二聚體少、退火溫度（Tm）盡可能接近的片段，設計長度約40 bp。針對每株致病性菌株設計1～3條探針，詳見表1。探針5'端氨基化修飾與合成均由上海杰李生物技術有限公司完成。

1. 4 芯片點制

將合成的探針與芯片點樣液等體積混合后，按點陣布局（圖1）點制在醛基基片上。通過水合（37 ℃下水合溫育2 h，過夜干燥）、紫外交聯（參數設為2400 MJ/cm2）加強探針固定效果，經NaBH4還原后以0.2% SDS和無菌水洗凈，4 ℃避光保存。

1. 5 芯片雜交

將PCR擴增獲得的特異性片段用帶Cy3熒光素標記的隨機引物9N進行熒光標記（用Klenow酶進行標記）。將雜交Buffer與熒光標記物配制成雜交體系20.0 μL，即4×雜交Buffer 5.0 μL，熒光標記產物15.0 μL；然后以芯片雜交盒進行雜交，65 ℃水浴2 h。芯片掃描儀掃描芯片（激光強度100%，PMT為100%），記錄檢測圖譜。

1. 6 芯片雜交條件優化

1. 6. 1 探針點樣濃度確定 采用晶芯Smart Arrayer 48微陣列芯片點樣系統以不同濃度點片，探針終濃度設30、20、10和5 μmol/L 4個梯度。每個濃度設3個重復。

1. 6. 2 UV紫外交聯時間確定 紫外照射能量和交聯時間對探針與芯片的結合固定有著直接影響。在設定紫外交聯能量為2400 MJ/cm2的前提下，設交聯時間分別為0.5、1.0、2.0和4.0 h。

1. 6. 3 雜交溫度確定 雜交溫度是影響雜交效果的重要因素，將點制完成玻片與熒光標記后的PCR產物進行雜交，雜交溫度設為55、60和65 ℃，分別雜交2.0 h。

1. 7 港口航道海水樣品檢測

分別于春、夏、秋三個季節采集上海洋山港附近5個水域（采樣點1：東經122°2′513″，北緯30°38′276″；采樣點2：東經122°4′150″，北緯30°37′；采樣點3：東經122°5′266″，北緯30°36′263″；采樣點4：東經122°5′680″，北緯30°36′30″；采樣點5：東經122°6′915″，北緯30°35′250″）的水樣，同一采樣時間的5個水樣混勻后作為1份待測海水樣品，分別編號為海水樣品1、海水樣品2和海水樣品3。經定性濾紙抽濾、0.45和0.22 μm孔徑硝酸纖維素膜過濾后，收集濾液多次過濾，10000 r/min離心濃縮至5.0 mL以內。菌體濃縮液樣品經LB液體培養基增菌培養（200 r/min，12 h），提取各菌株基因組總DNA，以16S rDNA通用引物和gyrB基因保守區引物進行PCR擴增，與優化后的芯片進行雜交。

2 結果與分析

2. 1 含特異性探針目的片段的擴增結果

由圖2可看出，從7株目標菌株中均擴增獲得16S rDNA（約1400 bp）和gyrB基因（約1000 bp）目的片段。

2. 2 芯片雜交條件優化結果

選擇不同的探針點樣濃度、紫外交聯時間和雜交溫度等進行雜交后，記錄各雜交掃描結果。在探針點樣濃度達10 μmol/L時，掃描熒光強度為3578，即可產生肉眼可見的清晰雜交信號（圖3）；紫外交聯時間為2.0 h已有較強的熒光強度（圖4），既可滿足芯片檢測的快速要求，又能縮短芯片檢測時間；當雜交溫度達65 ℃時，雜交信號較其他溫度強（圖5）。

2. 3 基因芯片檢測結果

基因芯片檢測結果（圖6）表明，7株目標菌株間均未出現非特異性雜交，說明設計的探針具有良好特異性，可用于副溶血弧菌、霍亂弧菌、哈氏弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、陰溝腸桿菌等病原菌的檢測。

2. 4 港口航道海水樣品檢測結果

以優化的基因芯片雜交檢測采集到的3份海水樣品，結果（圖7）顯示，海水樣品1檢出霍亂弧菌、哈氏弧菌、嗜水氣單胞菌、陰溝腸桿菌和溶藻弧菌，海水樣品2檢出霍亂弧菌、哈氏弧菌、嗜水氣單胞菌、陰溝腸桿菌和溶藻弧菌，海水樣品3檢出霍亂弧菌、創傷弧菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌。

3 討論

目前在港口航道微生物檢測中，對細菌的檢測仍以傳統微生物檢測與PCR相結合的方法為主，而采用基因芯片進行檢測的研究較少。在重要海域致病性細菌檢測方面，基因芯片檢測技術已初顯成效。郭建麗（2014）采用PCR與基因芯片相結合的方法，從大連海域的海濱浴場檢測出6種致病性細菌。本研究以港口航道致病性細菌為目標菌株，選擇16S rDNA通用引物以提高檢測效率；并通過對探針點樣濃度、紫外交聯時間和雜交溫度等條件的優化，最終確定探針點樣濃度為10 μmol/L、紫外交聯時間為2.0 h、雜交溫度為65 ℃，有效提高了基因芯片檢測的靈敏度，與傳統檢測方法相比可實現快速、高通量、準確的目標。

特異性是基因芯片檢測技術的關鍵，與選取的靶基因和篩選的引物、探針密切相關（肖翔等，2012；薛輝等，2015；蘇寧等，2016）。由于本研究中副溶血弧菌、霍亂弧菌、哈氏弧菌、創傷弧菌和溶藻弧菌等5株目標菌株的遺傳關系相近，因此在選擇靶基因時需嚴格篩選，且探針的特異性越高越好。將本研究設計的探針和引物在GenBank中進行BLAST比對，發現每條探針和引物序列均具有很高的特異性，且均未出現非特異性雜交。基因芯片檢測靈敏度是評價一種鑒定新方法的重要指標之一。本研究結果顯示，在探針點樣濃度10 μmol/L、掃描熒光強度3578的條件下，即可產生肉眼可見的清晰雜交信號，具有極高的靈敏度。基因芯片檢測技術不需要通過擴增目的片段來對結果進行判斷，更適合于復雜基質樣本致病菌的檢測與鑒定。本研究利用檢測這一優勢，實現對副溶血弧菌、霍亂弧菌、哈氏弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌和陰溝腸桿菌等7株致病性細菌進行同時檢測，具有良好的特異性，可在10 h內完成檢測鑒定，較常規的細菌學診斷更快速、簡便、經濟和實用，為流行病學調查和突發性傳染病早期診斷提供了一種有效的檢測手段。

4 結論

針對港口航道致病性細菌建立的微陣列基因芯片檢測技術具有特異性強、靈敏度高、快速便捷的特點，可用于港口航道及周邊地區的海洋環境監測和海產品質量安全檢測。

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（責任編輯 蘭宗寶）