Cu²⁺脅迫對羅氏沼蝦血清中抗氧化和免疫指標的影響

摘要：【目的】研究Cu2+脅迫對羅氏沼蝦血清中抗氧化和免疫指標的影響，為其養殖環境的調控提供科學依據。【方法】設置0（對照組）和100 μg/L（脅迫組）兩個Cu2+濃度，分別在羅氏沼蝦受Cu2+脅迫后的0、3、6、12、24和48 h取樣，分離血清，測定血清中總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）活力、丙二醛（MDA）含量，以及酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）活力。【結果】在Cu2+脅迫的3～12 h，羅氏沼蝦血清中T-AOC顯著升高（P<0.05，下同），并在12 h達峰值，脅迫后24和48 h顯著下降；與對照組相比，CAT活力在脅迫3 h時顯著升高，6 h時顯著下降，12 h時又顯著上升并達峰值，之后又逐漸降低，并在48 h時顯著低于對照組；脅迫組羅氏沼蝦血清中MDA含量在整個脅迫過程中呈先升高后略有降低的變化趨勢，且在各時間點均顯著高于對照組；ACP活力在脅迫后6和12 h顯著升高，24和48 h時降至初始水平；AKP活力在脅迫3～12 h內無顯著變化（P>0.05），脅迫后24和48 h顯著降低。【結論】Cu2+脅迫導致羅氏沼蝦脂質過氧化發生，機體通過調節抗氧化系統抵御Cu2+脅迫，抗氧化和免疫指標的變化具有一定時間效應，其中T-AOC、CAT活力和MDA含量對Cu2+脅迫較敏感，在脅迫短時間內即被顯著誘導，可作為Cu2+污染的潛在生物指示物。

關鍵詞： Cu2+脅迫；羅氏沼蝦；抗氧化能力；免疫；生物指示物

中圖分類號： S945.41 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）07-1323-06

0 引言

【研究意義】集約化和工業化水產養殖業的發展，給養殖水環境帶來了嚴重污染，重金屬是主要污染物之一，具有遺傳毒性、持久性和不可降解性等特點（陳彩芳等，2014）。有報道顯示，我國南海地區水域中銅（Cu）污染嚴重（Pan and Wang，2012），在珠江口地區的水生生物體內也檢測到較高濃度Cu（Ip et al.，2005；Wang et al.，2013），Cu被認為是該地區的主要金屬污染物（Bai et al.，2011）。Cu是蝦體內必需的微量營養素，不僅在調節蝦類生長、免疫、酶功能和組織完整性方面發揮重要作用，還是合成血藍蛋白的必需成分（Bharadwaj et al.，2014）。在生產實踐中，Cu常作為礦物營養素、除藻劑或病原抑制藥物被廣泛應用于水產養殖領域，但過量的Cu累積，會使養殖水體惡化（Liao et al.，2006）。研究表明，溶解態Cu的毒性明顯高于其他形式Cu，且毒性范圍也更廣（Gibbon-Walsh et al.，2012），對水產養殖業造成嚴重威脅。羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）又名大頭蝦、馬來西亞大蝦，是目前世界上養殖量最大的三大蝦種之一，也是我國重要的經濟甲殼動物。其在水生生態系統中分布較廣泛，在江河、湖泊等淡水和河口半咸水水域中均有分布，對水環境中各種理化性質的變化較敏感（朱春華等，2012）。因此，以羅氏沼蝦為對象，研究Cu2+脅迫對其血清中抗氧化和免疫指標的影響，對實際生產中監測Cu污染及提高羅氏沼蝦的抗Cu脅迫具有重要意義。【前人研究進展】當機體處于脅迫狀態時，總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量及過氧化氫酶（CAT）、堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活力均會隨著脅迫強度的不同呈規律性變化，這種高度敏感的生物反應指標稱為生物標志物（Regoli and Principato，1995）。目前，已有研究報道Cu2+脅迫對羅氏沼蝦存活率、滲透調節和病理變化等方面的影響，如Chen和Wang（2001）研究發現，Cu2+脅迫顯著降低了羅氏沼蝦酚氧化酶活性，從而提高其對格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）的易感性；Li等（2007）研究發現，Cu2+脅迫能顯著改變羅氏沼蝦鰓和肝胰腺的組織結構；Asih等（2013）的研究結果表明，Cu2+脅迫對不同發育時期羅氏沼蝦的存活、滲透調節和鰓的組織結構均有顯著影響；黎東（2013）研究發現，Cu2+能顯著抑制羅氏沼蝦仔蝦的生長，影響其卵巢發育；Guo等（2015）研究Cu2+脅迫下羅氏沼蝦血清中抗氧化酶基因表達量的變化，發現CAT、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等抗氧化酶的基因表達量被Cu2+顯著誘導。【本研究切入點】從生物標志物的角度研究Cu2+脅迫對羅氏沼蝦的毒性效應尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】通過監測Cu2+脅迫下羅氏沼蝦T-AOC、MDA含量及CAT、ACP和AKP活力的變化，探討Cu2+對羅氏沼蝦的毒性影響及其生理響應，為其養殖環境的調控提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

羅氏沼蝦購自湛江某養殖場，體重10.89±1.42 g，置于實驗室淡水循環水系統中暫養2周，水溫（26±2）℃，所有水質指標均符合《漁業水質標準》要求（國家海洋局，1989），暫養及脅迫試驗期間持續充氧。暫養期間每日在6：00和18：00投入蝦體重2%的餌料，脅迫試驗前24 h停止喂食。酶活力測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1. 2 脅迫試驗

試驗分對照組和脅迫組，每組設3個重復。根據 Chen和Wang（2001）的研究結果及預試驗結果發現，Cu2+脅迫濃度為100 μg/L時，可引起機體內生理生化變化并保證所有試驗沼蝦存活，故設置理論Cu2+脅迫濃度為0（對照組）和100 μg/L（脅迫組，用硫酸銅配置Cu2+溶液）兩個處理組。將羅氏沼蝦置于塑料箱中，脅迫組加入180 L硫酸銅溶液，每箱放蝦25尾，每24 h換硫酸銅溶液50%，對照組換水50%；分別在脅迫后0、3、6、12、24和48 h從每個箱中隨機選取3尾（n=9）羅氏沼蝦，參照Guo等（2013）的方法收集血淋巴800 g，4 ℃離心10 min，取上清分裝，-80 ℃保存備用。

1. 3 酶活力測定

采用比色法測定T-AOC，計算公式為：

1. 4 統計分析

所有數據均以3個平行組數據的平均值±標準差表示，并采用配對t檢驗法統計分析試驗組與對照組間的數據差異，P<0.05為顯著差異。

2 結果與分析

2. 1 Cu2+脅迫對羅氏沼蝦血清中T-AOC的影響

由圖1可知，在Cu2+脅迫開始的3 h，羅氏沼蝦血清中T-AOC即顯著上升（P<0.05，下同），并在脅迫12 h時達峰值（136.89 U/mL）；隨著Cu2+脅迫時間的延長，血清中T-AOC在24和48 h時逐漸下降，且顯著低于對照組。說明Cu2+脅迫初期可顯著誘導T-AOC，隨著脅迫時間的延長，顯著抑制機體的T-AOC。

2. 2 Cu2+脅迫對羅氏沼蝦血清中CAT活力的影響

由圖2可知，隨著Cu2+脅迫時間的延長，羅氏沼蝦血清中CAT活力呈波動式變化趨勢，與對照組相比，Cu2+脅迫3 h后的血清中CAT活力顯著升高，在6 h時顯著下降，脅迫12 h時又顯著上升并達峰值（25.23 U/mL），此后逐漸降低，48 h時CAT活力顯著低于對照組。說明Cu2+脅迫可顯著影響羅氏沼蝦機體的CAT活力。

2. 3 Cu2+脅迫對羅氏沼蝦血清中MDA含量的影響

如圖3所示，與對照組相比，羅氏沼蝦血清中MDA含量在Cu2+脅迫后3 h即被顯著誘導，6 h時雖有短暫降低，但仍與對照組有顯著差異。MDA含量在脅迫12 h時達峰值（22.86 nmol/mL），24和48 h時也顯著高于對照組。說明Cu2+脅迫能顯著提高羅氏沼蝦血清中MDA含量。

2. 4 Cu2+脅迫對羅氏沼蝦血清中ACP活力的影響

如圖4所示，在Cu2+脅迫后的3 h內，Cu2+對羅氏沼蝦血清中ACP活力無顯著影響（P>0.05，下同），在Cu2+脅迫后的6和12 h，羅氏沼蝦血清中ACP活力明顯升高，且顯著高于對照組；隨著脅迫時間的延長，ACP活力又逐漸降至初始水平。說明Cu2+脅迫在一定時間內能顯著影響羅氏沼蝦血清中ACP活力。

2. 5 Cu2+脅迫對羅氏沼蝦血清中AKP活力的影響

如圖5所示，在脅迫3～12 h內，Cu2+對羅氏沼蝦血清中AKP活力無顯著影響，在脅迫后的24和48 h，羅氏沼蝦血清中AKP活力與對照組相比顯著降低。說明在Cu2+脅迫后期，可顯著抑制羅氏沼蝦機體的AKP活力。

3 討論

活性氧（ROS）在機體的免疫防御過程中發揮著重要作用。在正常生理狀態下，ROS的產生和消除處于平衡狀態（Lushchak，2011），但當有害物質入侵機體時，ROS的平衡狀態會被打破（Achard-Joris et al.，2006）。過多ROS會對機體造成細胞損傷，在進化過程中，機體形成了相應的抗氧化機制避免細胞組分受到氧化損傷（Griboff et al.，2014），包括超氧化物歧化酶（SOD）和CAT等在內的抗氧化酶系統被認為是機體對抗氧化損傷的第一道防線。溫度、鹽度、亞硝酸鹽等環境因子的脅迫，均會影響蝦類抗氧化酶的變化（Guo et al.，2013；Xian et al.，2013；Vinagre et al.，2014）。

T-AOC是用于衡量機體抗氧化系統功能狀況的綜合性指標，反映機體對外來刺激的代償能力及機體自由基代謝的狀態，包括酶促反應和非酶促反應兩個體系。其中酶促反應體系包括SOD和CAT等抗氧化酶類；非酶促反應體系包括維生素、類胡蘿卜素、氨基酸和金屬蛋白等抗氧化劑（管越強等，2011）。段亞飛等 （2015）研究表明，在感染鰻弧菌（Vibrio anguillarum）初期，脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）鰓中的T-AOC呈上升趨勢，表明鰻弧菌感染誘導機體免疫反應產生ROS殺滅病原菌，從而激活機體抗氧化酶系統，在感染后期，鰓中T-AOC逐漸下降，推測是由于弧菌的繁殖抑制了機體抗氧化酶活性，使抗氧化防御系統下降。本研究結果表明，在Cu2+脅迫下，羅氏沼蝦血清中T-AOC呈先升高后降低的變化趨勢，在脅迫3～12 h，T-AOC顯著上升，可能是Cu2+脅迫作用使羅氏沼蝦體內的ROS含量增加，刺激酶促反應體系中各種酶活力升高，從而提高了T-AOC來清除體內過多的ROS；而隨著脅迫時間的延長，產生過量ROS，會對各種抗氧化酶活力產生部分抑制作用，而機體在清除ROS的同時自身的抗氧化酶也會被消耗掉，因此，在脅迫后24～48 h，T-AOC顯著降低，與管越強等（2011）研究硫化物脅迫對日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）抗氧化系統的影響發現低濃度硫化物組的日本沼蝦在脅迫試驗前期T-AOC升高，而后隨著脅迫時間的延長，T-AOC顯著下降的結果一致。

CAT是一種普遍存在于古細菌、原核生物和真核生物中的高度保守酶，對維持細胞內的氧化還原平衡起著重要作用，可催化H2O2轉化成H2O和O2，從而降低其毒性（Arockiaraj et al.，2012；Rama and Manjabhat，2014）。本研究中，在Cu2+脅迫初始階段，CAT活力被顯著誘導，但在6 h時又顯著降低，可能是由于此時的H2O2不足以為CAT提供底物（孟曉林等，2015）。在脅迫后12和24 h，H2O2又重新積累，為CAT提供了足夠的反應底物，此時CAT活力又重新恢復，但隨著脅迫時間的延長，CAT抗氧化能力也逐漸減弱。這與Cu2+脅迫下蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）鰓和肝胰腺中CAT活力的變化趨勢一致（孟曉林等，2015）。

MDA是脂質過氧化的產物，可反映細胞氧化損傷的程度（Sila et al.，2015），已被廣泛用于水生生物的毒理學研究（Wang et al.，2012；Li et al.，2013，2016；Xu et al.，2014）。已有研究發現，Cu2+脅迫能顯著提高草魚（Ctenopharyngodon idella）鰓組織和克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）血清中的MDA含量（Wang et al.，2015；Wei and Yang，2016）。本研究也發現，Cu2+脅迫可顯著增加羅氏沼蝦血清MDA含量，說明Cu2+脅迫可導致水產動物脂質過氧化的發生。

ACP和AKP是甲殼動物體內的2種非特異性免疫因子，在其免疫反應過程中具有防御和消化的雙重作用（鐘君偉等，2014；周冬仁等，2015）。因此，ACP和AKP活力是判斷甲殼動物免疫狀態的重要指標。ACP是巨噬細胞溶酶體的標志酶，在體內直接參與磷酸基團的轉移和代謝，在調節DNA、蛋白質和脂質代謝過程中起重要作用，且容易受外界影響（李玉全，2014；譚樹華等，2014）。據報道，羅氏沼蝦在遭受螺原體MR-1008感染（Du et al.，2013）和環境因子脅迫（王玥等，2005；朱春華等，2012）時，ACP活力均被顯著誘導。本研究也發現，在Cu2+脅迫后6和12 h，ACP活力被顯著誘導，在24和48 h時，ACP活力又逐漸降低，但與對照組無顯著差異。推測羅氏沼蝦在受到Cu2+脅迫時，機體需通過增加體內的ACP活力去參與免疫調節，以對抗Cu2+帶來的氧化損傷，長時間的Cu2+脅迫會嚴重影響蝦的物質代謝過程和免疫力，導致ACP活力下降（譚樹華等，2014）。

AKP是一種磷酸單酯酶，是生物體磷代謝的關鍵酶之一，其活性中心具有Zn2+。水體中的Cu2+可由鰓進入血液，使血液中的Cu2+濃度發生改變。本研究結果表明，在脅迫12 h內，Cu2+脅迫對AKP活力無顯著影響，脅迫后24和48 h時，Cu2+顯著抑制了AKP活力。這可能是因為Cu和Zn為同族元素，相互之間存在拮抗作用，從而使AKP活力受到抑制（王維娜等，2001），也可能是因為長時間的Cu2+脅迫擾亂了沼蝦自身生理調節過程，破壞了酶蛋白本身，導致抑制效應。

4 結論

Cu2+脅迫導致羅氏沼蝦脂質過氧化的發生，機體通過調節抗氧化系統抵御Cu2+脅迫，抗氧化和免疫指標的變化具有一定時間效應，其中T-AOC、CAT活力和MDA含量對Cu2+脅迫較敏感，在脅迫短時間內即被顯著誘導，可作為Cu2+污染的潛在生物指示物。

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（責任編輯 羅 麗）