第一、二代轉cp4—epsp基因大豆鑒定方法的建立

摘要：【目的】建立一種廣譜性鑒定第一、二代轉cp4-epsp基因大豆的檢測方法，為準確鑒定第一、二代轉cp4-epsps基因大豆及其產品提供技術支持。【方法】根據第一、二代轉基因大豆的cp4-epsp基因保守序列設計一對能同時鑒定兩代轉基因大豆外源基因cp4-epsps的引物和探針，建立一種廣譜性鑒定第一、二代轉cp4-epsps基因大豆的方法，并從準確性、特異性、靈敏性及重復性4個方面對該方法進行評估。【結果】設計的引物/探針對鑒定第一、二代轉cp4-epsps基因大豆及其產品具有廣譜性；建立的檢測方法能檢測到反應體系中低至5×100拷貝的cp4-epsps基因，Ct為38.88，且能同時檢測出兩代轉基因大豆。準確性和特異性評估結果顯示僅兩代轉cp4-epsp基因的大豆能被檢測到；40次重復試驗結果顯示，反應體系中5×100拷貝的cp4-epsps基因片段的檢出率為100%。【結論】建立的第一、二代轉cp4-epsps基因大豆鑒定方法具有特異強、靈敏度高、重復性好、準確性高等特點，可用于轉cp4-epsp基因大豆及其產品的監測。

關鍵詞： 轉基因大豆；cp4-epsps基因；廣譜性；特異性；靈敏度

中圖分類號： S565.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）07-1155-06

0 引言

【研究意義】cp4-epsps是土壤農桿菌（Agrobacterium sp.）CP4株系的一段編碼5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的基因序列，由于其編碼的EPSPS較植物體內的EPSPS對草甘膦除草劑更具耐受性（王關林和方宏筠，2005），因此cp4-epsps基因被轉入植物中以增強植物對草甘膦除草劑的抵抗力。自2004年起，我國已批準進口用作加工原材料的轉基因大豆有12種，其中MON87769和305423是改良品質的轉基因大豆，MON87701是抗蟲大豆，其余9種轉基因大豆是抗除草劑大豆（王國英，2001；蘭青闊等，2008；汪琳等，2011；朱琳峰等，2015）。在抗除草劑大豆中，第一代轉基因大豆GTS40-3-2和第二代轉基因大豆MON89788是進口量較大的兩個品種，均被轉入cp4-epsps抗除草劑基因，為了同時準確鑒定兩代轉基因大豆，建立一種廣譜性鑒定第一、二代轉cp4-epsps基因大豆的檢測方法，對保護消費者的知情權和選擇權具有重要意義。【前人研究進展】蘭青闊等（2008）、汪琳等（2011）、肖笑（2012）及朱琳峰等（2015）均根據第一代轉基因大豆GTS40-3-2中的cp4-epsps基因序列（GenBank登錄號AB209952和I43998）建立了轉基因大豆檢測方法，但其僅能鑒定第一代轉基因大豆。早期，我國行業標準中也有一些針對轉基因大豆中cp4-epsps基因的檢測方法，如GB/T 19495.4-2004、GB/T 19495.5-2004、GB/T 19495.6-2004等（中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，2004a，2004b，2004c），但這些方法無法明確指出檢測對象是第一代還是第二代轉cp4-epsps基因大豆，且很難準確檢測到第二代轉cp4-epsps基因大豆中的cp4-epsps基因。我國農業部基于End Point PCR原理設計了能同時檢測第一、二代轉cp4-epsps基因大豆中cp4-epsps基因的簡并引物（農業部1861號公告-5-2012），但與Real Time PCR相比，該方法還需進一步通過測序或Southern Blotting驗證PCR產物，檢測過程相對繁瑣。【本研究切入點】采用上述方法很難準確快捷鑒定出以第二代轉cp4-epsps基因大豆為原材料加工生產的食品，存在漏檢第二代轉cp4-epsps基因大豆及其產品的可能，目前能同時鑒定兩代轉基因大豆的方法鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】建立了一種基于Real Time PCR原理能同時準確鑒定含第一、二代轉cp4-epsps基因大豆及其產品的廣譜性方法，為精準鑒定轉基因大豆食品提供技術支持，以保護消費者的知情權和選擇權。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

轉cp4-epsps基因大豆GTS40-3-2和MON89788粉末及用于驗證方法特異性的其他轉基因作物粉末標準物質均購自歐盟聯合研究中心測量與標準物質研究所（IRRM）。主要試劑：植物基因組DNA純化試劑和探針型（TaqMan水解探針）Real Time PCR Master Mix均購自天根生化科技（北京）有限公司。主要儀器設備：超微量分光光度計（Nanodrop 1000，Thermo Fisher Scientific Corporation，USA）和實時熒光PCR系統（Real Time PCR System 7500， Applied Biosystem Corporation， USA）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 DNA分離與純化 分別稱取轉cp4-epsps基因大豆GTS40-3-2和MON89788粉末、含量為3%的GTS40-3-2大豆粉末及其他非轉基因粉末樣品各100 mg。參照植物基因組DNA純化試劑盒說明分離、純化各樣品中的基因組DNA。

1. 2. 2 引物和探針設計 為了驗證是否成功提取大豆DNA，采用國家標準GB/T 19495.4-2004中的引物/探針序列，擴增大豆內標基因Lectin；用生物信息學方法BLAST比對GenBank中大豆GTS40-3-2的cp4-epsps基因序列（SEQ1，GenBank登錄號I43998）和大豆MON89788的cp4-epsps基因序列（SEQ2，GenBank登錄號GV597339），查找cp4-epsps基因的保守序列。根據保守序列，采用Primer Express設計能同時準確擴增大豆GTS40-3-2和MON89788 cp4-epsps基因的引物和探針（表1）。擴增cp4-epsps基因探針標記的熒光基團和猝滅基團分別是6-羧基熒光素（FAM）和6-羧基四甲基羅丹明（TAMRA）。

1. 2. 3 Real Time PCR擴增 將各樣品的基因組DNA溶液稀釋至25 ng/μL。反應體系（25.0 μL）：DNA稀釋液3.0 μL，2×Taq Man Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，探針（10 μmol/L）0.5 μL，補ddH2O至25.0 μL。設置陽性對照和空白對照，每個樣品設2個重復。把配制好的反應體系置于7500型熒光定量PCR儀器上，擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，進行45個循環。

1. 2. 4 檢測方法評估 用設計的引物和探針擴增轉基因玉米（TC1507、NK603、MON863、MON810和3272）粉末混合樣品、轉基因大豆（GTS40-3-2和MON89788）、非轉基因大豆、轉基因棉花、轉基因油菜、轉基因甜菜種子粉末混合樣品，以確定檢測方法的特異性。

將分離、純化得到含量為3%的大豆GTS40-3-2樣品DNA溶液稀釋成50 ng/μL，然后再按照1∶10比例梯度稀釋至5×100、5×10-1和5×10-2 ng/μL。根據大豆基因組大小（1.115×109 bp）（Arumuganathan and Earle，1991），計算出含量為3%的GTS40-3-2大豆粉末樣品DNA濃度為5×101、5×100、5×10-1和5×10-2 ng/μL的溶液分別對應含cp4-epsps基因1×103、1×102、1×101和1×100拷貝/μL。分別在反應體系中加入5.0 μL上述4個濃度的DNA溶液作為模板，使反應體系中cp4-epsps基因含量分別含5×103、5×102、5×101和5×100拷貝，實時擴增cp4-epsps基因以測定檢測方法的靈敏度（鑒定下限）。對初步獲得的靈敏度進行40次重復實驗，進一步確定靈敏度的置信概率，同時驗證檢測方法的重復性。

此外，將含量為3%的GTS40-3-2大豆粉末樣品和其他非轉基因樣品在相同的反應條件下用該方法進行分析鑒定，用已知含量為3%的GTS40-3-2大豆粉末樣品的鑒定結果作為該方法的準確性評價指標。

2 結果與分析

2. 1 引物和探針設計

將大豆GTS40-3-2的cp4-epsps基因序列（SEQ1）與大豆MON89788的cp4-epsps基因序列（SEQ2）用DNAMAN v6.0進行比對分析，找到了333 bp的相對保守序列（圖1），且二者的同源性僅為81%。采用Primer Express v3.0對SEQ1與SEQ2的333 bp保守序列進行搜尋，找到了一對用軟件評估罰分（Penalty）最小的引物/探針。PCR產物長度為68 bp。

2. 2 轉cp4-epsps基因大豆的擴增結果

用設計的引物/探針擴增大豆GTS40-3-2和MON89788，結果（圖2）顯示，第一、二代轉cp4-epsps基因大豆中的cp4-epsps基因均被擴增，擴增圖譜呈S形曲線。由此可見，本研究設計的引物/探針能實時鑒定兩代轉cp4-epsps基因大豆，該引物/探針對鑒定第一、二代轉cp4-epsps基因大豆具有廣譜性。

2. 3 檢測方法的評估結果

特異性評估結果（圖3）顯示，建立的檢測方法除了能準確鑒定轉基因大豆GTS40-3-2和MON89788外，無法鑒定其他樣品。靈敏度評估結果（圖4）顯示，建立的檢測方法能檢測到反應體系中低至5×100拷貝的cp4-epsps基因，Ct為38.88（表2）。為了排除偶然因素，對5×100拷貝的cp4-epsps基因進行40次重復試驗，結果（圖4）表明，反應體系中5×100拷貝的cp4-epsps基因片段檢出率為100%，重復試驗結果的Ct分布在36.97～ 39.11，平均值為38.01。因此，建立的檢測方法特異性強，靈敏度高，且具有較好的重復性。此外，從待測盲樣中，含量為3%的GTS-40-3-2大豆被鑒定出（Ct為25.47），表明建立的檢測方法準確性高。

3 討論

轉基因生物技術是近20年顛覆性科學技術之一（焦悅等，2016），許多優良品質的轉基因生物及其產品在各領域被商業化應用，如通過轉基因植物反應器生產醫用抗生素，利用各種生物工程細菌生產疫苗，種植抗蟲、抗病毒、抗環境脅迫等轉基因作物以應對來自蟲害、病害、不利環境的影響（慈曉燕，2004；馬玉婷，2008；Wang et al.，2011；張磊，2011；賀明艷，2015）。由于轉基因生物是基因重組技術獲得，不是天然存在，因此轉基因生物及其產品的安全性一直備受懷疑（常超和伍金娥，2007；Ruane and Sonnino，2011；Aleksejeva et al.，2014）。轉基因食品的食用安全性也一直是公眾關注的焦點（王國英，2001；玄立杰和謝英杰，2010；王磊和李曉蘭，2014）。我國從2001年開始集中出臺了一系列轉基因生物安全監管的法律和規章制度，對轉基因生物及產品的研發、進口、流通和應用等環節進行了具體規定。技術監測轉基因生物及產品是保障這些法律和規章制度得以徹底貫徹和實施的重要前提和必要手段。

本研究發現，雖然第一代轉基因大豆GTS40-3-2和第二代轉基因大豆MON89788均被轉入cp4-epsps抗除草劑基因，但二者的cp4-epsps基因序列只有81%的同源性，可能是為了增強表達蛋白質的抗除草劑能力，導致第二代轉基因大豆MON89788的cp4-epsps基因部分堿基發生了修飾改變，因此原方法無法準確鑒定第二代轉cp4-epsps基因大豆。本研究針對上述問題設計了一對特異引物和探針，建立了一種廣譜性鑒定轉cp4-epsps基因大豆及其產品的Real Time PCR檢測方法。一種新建的鑒定方法，需從特異性、準確性、靈敏性及重復性等角度進行評價。引物和探針的高特異性是PCR的首要前提（宋君等，2014）。本研究設計的引物/探針和優化的反應體系可鑒定10種轉基因樣品，僅含cp4-epsps基因的大豆GTS40-3-2和MON89788 2個樣品能檢測到積累的熒光信號，表明本研究建立的方法對兩代轉cp4-epsps基因大豆具有高度特異性，在實際應用中不會因方法的非特異性導致假陽性鑒定結果。評估一種鑒定方法的準確性，一般采用已知的樣品作為盲樣進行鑒定。盲樣的鑒定結果是反映方法準確性的主要指標，本研究建立的方法能準確鑒定混在其他樣品中含量為3%的GTS40-3-2大豆盲樣，表明該方法準確性高。靈敏性是表征方法的鑒定能力，即能準確鑒定被鑒定對象的最小量。因此，靈敏度是考察一種鑒定方法的重要指標。理論上，利用PCR可檢測到1拷貝的DNA分子，但在分析實踐中，常因DNA等大分子溶液的均一性低于離子化合物溶液的均一性及微量液體轉移等問題檢測不到1拷貝的DNA片段（宋君等，2014）。本研究經過40次重復實驗均能檢測到僅有5×100拷貝的cp4-epsps基因片段，充分表明建立的檢測方法具有高度靈敏性，達到歐盟轉基因生物檢測方法的不高于5×100拷貝的靈敏度要求（Scholtens et al.，2010）。由于在評估方法的靈敏度研究中重復了40次試驗，因此本研究未專門設置方法的重復性實驗。40次5×100拷貝的cp4-epsps基因重復被鑒定出，充分說明該檢測方法的重復性較好。

4 結論

建立的第一、二代轉cp4-epsps基因大豆鑒定方法具有特異強、靈敏度高、重復性好、準確性高等特點，可用于轉cp4-epsps基因大豆及其產品的監測。

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（責任編輯 陳 燕）