黃芪—莪術不同提取物抗腫瘤作用研究

姚遠+仝立國+馮瑪莉+范惠霞

[摘要] 目的 研究不同方法提取的黃芪-莪術提取物的抗腫瘤作用。 方法 建立人肝癌細胞株HepG2模型，分別以95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、傳統水煎四種方法為提取工藝，用CCK-8法檢測不同提取物對HepG2細胞抑制生長作用，并用流式細胞法檢測其體外誘導HepG2細胞凋亡的情況。用小鼠肝癌H22細胞建立移植性肝癌模型，檢測上述提取物體內抗腫瘤活性，用免疫組織化學法檢測H22肝癌組織中NF-κB p65的表達情況。 結果 CCK-8結果顯示，與陰性組相比，黃芪-莪術95%乙醇和50%乙醇提取物組最高抑制率分別為89.13%、78.36%，差異有統計學意義（P<0.05），醇沉和水煎提取物組最高抑瘤率分別為20.38%、18.78%，差異無統計學意義（P>0.05）。流式細胞術結果顯示，95%乙醇提取組和50%乙醇提取物組能明顯誘導HepG2細胞凋亡，水提醇沉組和傳統水煎組效果不明顯。95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、傳統水煎四種提取物對小鼠H22荷瘤均有一定的抑瘤效果，抑瘤率分別為47.55%、36.12%、29.96%、34.68%。與模型組相比，95%乙醇和50%乙醇提取物組能明顯降低H22荷瘤組織中NF-κB p65水平的表達 （P<0.05）。 結論 黃芪-莪術95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、傳統水煎四種提取物均有抑制小鼠H22荷瘤生長作用，但是只有95%乙醇和50%乙醇提取物能抑制NF-κB p65蛋白的表達，并有抑制人肝癌HepG2細胞生長及誘導其發生細胞凋亡的作用。

[關鍵詞] 黃芪；莪術；HepG2細胞；細胞凋亡；NF-κB p65

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）07-0033-04

[Abstract] Objective To study the anti-tumor effect of the extract of Astragalus and Curcuma zedoaria Rosc by different methods. Methods Liver cancer cell line HepG2 model was established by four kinds of methods including 95% ethanol， 50% ethanol， water extraction and ethanol precipitation and the traditional decoction for the extraction process.The inhibitory effect of different extracts on the growth of HepG2 cells was detected by CCK-8 method.And the apoptosis of HepG2 cells was detected by flow cytometry.The model of transplanted hepatocellular carcinoma（HCC） was established by mouse liver cancer H22 cells.The antitumor activity in the above-mentioned extract was examined. The expression of NF-κB p65 in H22 hepatocellular carcinoma tissues was detected by immunohistochemistry. Results The CCK-8 results showed that the highest inhibitory rates were 89.13% and 78.36% in Astragalus-Curcuma 95% ethanol and 50% ethanol extraction groups respectively compared with that in the negative group， and the difference was significant （P<0.05） .The highest inhibitory rates were 20.38% and 18.78% respectively in ethanol precipitation and decoction extraction groups， and the difference was not significant（P>0.05）.The results of flow cytometry showed that 95% ethanol extraction group and 50% ethanol extraction group could obviously induce HepG2 cell apoptosis， while the roles of the water extraction and alcohol precipitation group and the traditional decoction group were not obvious.Four extracts including 95% ethanol， 50% ethanol， water extraction and ethanol precipitation and traditional decoction all had inhibitory effect on H22 tumor in mice. The tumor inhibition rates were 47.55%， 36.12%， 29.96% and 34.68% .Compared with the model group， 95% ethanol and 50% ethanol extraction groups could significantly decrease the expression level of NF-κB p65 in H22 tumor tissue（P<0.05）. Conclusion Astragalus and Curcuma zedoaria Rosc 95% ethanol， 50% ethanol， water extraction ethanol precipitation and traditional decoction could inhibit the growth of H22 tumor in mice.But only 95% ethanol and 50% ethanol extracts could inhibit the expression of NF-κB p65 protein， and have the effect of inhibiting the growth of human liver cancer HepG2 cells and inducing the apoptosis of HepG2 cells.

[Key words] Astragalus； Curcuma zedoaria Rosc； HepG2 cells； Apoptosis； NF-κB p65

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球是第五個最常見的癌癥，由于乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染的傳播其發病率正在世界范圍內不斷增加，特別是肝硬化患者最易發生[1]。我國是肝細胞肝癌高發區，且死亡率均高于世界其他國家的平均水平，每年全球新發的肝癌病例中，我國就占到一半以上[2]。目前肝癌的治療手段仍以化療和早期手術切除為主，但能手術切除者僅占10%～15%[3]。因此肝癌的內科治療對于中晚期患者來說顯得非常重要。中藥可作用于腫瘤發生和發展的多環節、多靶點，防止復發轉移，副作用輕，價格低廉等優點而倍受關注。所以近年來中醫藥治療腫瘤的研究的得到廣泛關注，在抗腫瘤方面取得了可喜的成就。細胞凋亡普遍存在于生物界。在腫瘤的發生過程中，NF-κB的過度表達，會減少細胞凋亡發生，抑制其在腫瘤細胞中的過表達，在腫瘤的治療中意義重大[4]。本文主要闡述黃芪-莪術不同提取物抑制人HepG2細胞生長及誘導其凋亡的作用和對小鼠H22荷瘤組織中NF-κB p65蛋白調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

氟尿嘧啶注射液（上海旭東海普藥業有限公司，批號：FA150205）；注射用環磷酰胺 （CTX，山西普德藥業股份有限公司，批號：04141102）；黃芪 （產自甘肅，生產批號：150502），莪術（產自廣西，批號：150403），均購買于毫州成源中藥飲片有限公司。

1.2 試劑

CCK-8 （日本同仁，批號：FJ692）；細胞凋亡檢測試劑盒（凱基生物，批號：20150528）；NF-κB p65（北京博奧森生物，批號：AE063028）。

1.3 動物與瘤株

昆明種小鼠[（購自北京海淀興旺實驗動物養殖場，雌雄各半，許可證號：SCXK（京）2014-0013）]；HepG2 細胞由山西醫科大學細胞生物教研室惠贈；H22細胞由山西省腫瘤醫院惠贈。

1.4 儀器

BioTeK酶標儀（美國BioTeK）；Cytomics流式細胞儀（美國BECKMAN，FC 500型）；旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠，RE-6000A型）；離心沉淀機（上海醫用分析儀器廠，LXJ-Ⅱ型）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械廠，101-2-S型）。

1.5 方法

1.5.1 藥物提取 稱取黃芪-莪術（1∶1）各200 g，粉碎成粗粉。（1）采用95%乙醇對黃芪-莪術中的揮發油以及極性較小的脂溶性成分進行提取。將粗粉加6倍量95% 乙醇，回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濃縮干燥，即得95% 乙醇提取物。（2）采用50%乙醇對黃芪-莪術中的三萜類、皂苷類以及黃酮類等中等極性成分進行提取。方法同（1）。（3）采用水提醇沉法對黃芪-莪術中的粗總多糖進行提取。將兩藥材加8倍量水，提取3次，合并提取液，濃縮至一定體積后加三倍體積80%乙醇沉，放置過夜，離心，收集沉淀物，干燥，即得水提醇沉提取物。（4）采用水煎煮法對黃芪-莪術混合進行提取。將兩藥材加8倍量水，提取3次，每次1.0 h，合并提取液，濃縮干燥，即得水煎提取物。

1.5.2 黃芪-莪術不同提取物對HepG2細胞增殖和凋亡的影響 （1）細胞增殖抑制率：收集對數期細胞，離心，去上清，加入37℃預熱培養基混勻，用細胞計數板在顯微鏡下細胞計數，細胞接種濃度為：1.5×105個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，放入37℃，5% CO2培養箱中孵育24 h，各組給藥終濃度分別為：95%乙醇提取物組（800、400、200、100、50 μg/mL）；50%乙醇提取物、水提醇沉物組和傳統水煎物組（2000、1000、500、250、125 μg/mL），陽性對照組為順鉑 2 μg/mL，每組設3個復孔。在加藥后24 h，通過CCK-8法檢測每個組的OD450值，分別計算細胞抑制率，每組結果用三個復孔平均值表示。實驗重復3次。細胞增殖抑制率=（陰性組OD450-實驗組OD450）/（陰性組OD450-空白組OD450）×100%。（2）細胞凋亡率：根據CCK-8的結果選取黃芪-莪術95%乙醇提取物組 （400 μg/mL）；50%乙醇提取物、水提醇沉物組和傳統水煎物組（2000 μg/mL）進行細胞凋亡檢測。取對數期細胞，調整細胞濃度為2×105/mL，接種于6孔板，給藥24 h后，1000轉/min離心5 min，收集細胞，用1×PBS洗兩遍，根據試劑及流式細胞儀器說明檢測各組HepG2細胞凋亡情況。

1.5.3 黃芪-莪術不同提取物對小鼠H22荷瘤生長抑制作用 在無菌條件下，將H22小鼠乳白色腹水，按1∶10加入生理鹽水，沖打混勻。醫用酒精消毒小鼠右上腋窩部位，皮下接種0.2 mL細胞懸液。分為模型組、陽性組、95% 醇提組、50%醇提組、水提醇沉組、傳統水煎組共6組，每組10只，雌雄各半。接種24 h后給藥，灌胃給藥，模型組每天灌等劑量的生理鹽水，陽性組給予環磷酰胺（30 mg/kg），隔天腹腔注射。連續灌胃11 d后，稱重，在無菌條件下剝離瘤塊并稱重。腫瘤抑制率=（模型組平均瘤重-實驗組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。

1.5.4 免疫組化法檢測H22小鼠荷瘤組織中NF-κB p65分子表達情況 將H22荷瘤組織放入4% 的多聚甲醛固定，常規脫水后用石蠟包埋，厚度4 μL連續切片，按照試劑盒的說明完成免疫組織化學染色。用Image Pro-Plus 6.0軟件400倍拍攝照片，選擇陽性目標染色區域，測量其累積分光密度（IOD Sum）和面積累加值（area Sum），結果用平均積分光密度（mean density）=（IOD Sum）/（area Sum）表示。

1.6 統計學方法

采用SPSS19.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05代表具有統計學差異。

2 結果

2.1 黃芪-莪術四種不同的提取物對HepG2細胞增殖的抑制作用

用CCK-8法檢測黃芪-莪術四種不同提取物對HepG2細胞增殖的影響，95%乙醇、50%乙醇、醇沉和水煎提取物最高抑制率分別為89.13%、78.36%、20.38%、18.78%，見表1。

2.2 黃芪-莪術不同提取物對HepG2細胞凋亡的影響

經黃芪-莪術不同提取物處理24 h后的HepG2肝癌細胞，用流式細胞儀檢測，95%醇提物、50%醇提物、醇沉物和水煎物組早期凋亡率分別為49.6%、46.2%、10.1%、12.3%。與陰性對照組比，95%醇提物和50%醇提物組能明顯誘導HepG2細胞凋亡，見封三圖3。

2.3 黃芪-莪術不同提取物體內對H22實體瘤的抑制作用

統計結果顯示，黃芪-莪術四個提取物組的平均瘤重低于模型組，與模型組相比均有顯著性差異，95%醇提取物組、50%乙醇提取物組、醇沉提取物組、水煎提取物組抑瘤率分別為47.55%、36.12%、29.96%、34.68%，結果見表2。

2.4 各組H22荷瘤組織中NF-κB p65蛋白表達情況

免疫組織化學結果顯示，與模型組相比，95%醇提取物組和50%醇提取物組中NF-κB p65蛋白表達水平降低，差異有顯著性（P<0.01），醇沉物和水煎物組有降低趨勢，但是與模型組相比較差異無統計學意義。見表3、封三圖4。

3 討論

黃芪為補氣類代表藥物，具有補氣固表，利尿脫毒、排膿、斂瘡生肌等功效。現代研究表明其主要成分為多糖類、黃酮類、皂苷類以及微量元素和氨基酸等成分[5]。莪術為行氣活血類代表藥物，具有行氣破血，消積止痛的功效，用于癥瘕痞塊，瘀血閉經，食積脹痛等癥。現代研究表明其主要成分是莪術油[6]。二者的有效成分對某些腫瘤細胞有直接的抑制作用，且在機體整體水平有抑瘤作用，如治療胃癌、肝癌、婦科腫瘤等方面已發揮初步成效[7-9]。本實驗用不同種屬來源肝癌細胞人HepG2肝癌細胞和小鼠H22肝癌細胞為研究對象，發現黃芪-莪術95%乙醇提取物、50%乙醇提取物、水提醇沉物和水煎提取物雖然對小鼠肝癌H22荷瘤都有一定抑制作用，但是只有95%乙醇提取物和50%乙醇提取物對人肝癌HepG2細胞有明顯抑制作用。

細胞凋亡（apoptosis）是機體細胞一種自發的、有條理的生理代謝過程。細胞凋亡與生物的發育、機體免疫功能穩定以及腫瘤的發生有著密切的聯系。腫瘤的發生最主要的原因就是一系列可以誘導細胞凋亡啟動的因子（ced基因家族、Caspase基因家族、P53基因等）受到抑制，使細胞凋亡程序不能正常啟動從而不能清除癌基因及其產物。所以細胞凋亡激活細胞發生細胞凋亡的程序，特異的殺傷腫瘤細胞，是腫瘤治療的重要手段。在本實驗中發現，四個黃芪-莪術提取中，只有95%乙醇提取物和50%乙醇提取物可以明顯誘導人HepG2肝癌細胞凋亡，所以黃芪-莪術95%乙醇提取物和50%乙醇提取物誘導HepG2細胞凋亡是二者抗腫瘤作用機制之一。

NF-κB（nuclear factor-κB）是一種細胞核轉錄因子，與腫瘤細胞的發生、凋亡、侵襲和轉移等密切相關而備受關注。在哺乳動物細胞中常以NF-κB p65與NF-κB p50 結合形成二聚體。NF-κB的激活受廣泛的信號調節，其中大多數信號與細胞應激有關[10，11]。靜息狀態下，NF-κB主要與其抑制因子（I-κBα）結合形成復合體定位于細胞質中。當被淋巴因子、細胞因子、藥物等激活后，I-κBα被水解釋放出NF-κB，最后轉移到細胞核[12]。大多數腫瘤細胞中NF-κB信號通路都處于持續激活狀態。激活的NF-κB可以抑制TNF-α、促進VEGF等的表達，從而促進腫瘤細胞生長轉移[13]。研究表明[14，15]，黃芪、莪術有抑制胃癌和乳腺癌細胞中NF-κB的表達作用。本文研究發現，與模型組相比，NF-κB p65蛋白的表達量只在95%乙醇提取物和50%乙醇提取物組明顯降低 （P<0.01）。提示黃芪-莪術95%乙醇提取物和50%乙醇提取物抗腫瘤作用與有降低NF-κB p65蛋白降低有關。

綜上所述，黃芪-莪術95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉和水煎四種提取物均有抑制小鼠H22荷瘤生長的作用，其中只有95%乙醇和50%乙醇提取物有抑制H22荷瘤組織中NF-κB p65蛋白表達和抑制人肝癌HepG2細胞生長及誘導其發生凋亡的作用。

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（收稿日期：2016-12-09）