14-3-3 zeta蛋白過表達與他莫昔芬治療乳腺癌耐藥的關系

凌人，凌今，2，陳仲華，劉丹丹，趙宏圻，柯友濤

（1.金華廣福醫院 病理科，浙江 金華 321000；2.復旦大學 藥學院，上海 201203）

14-3-3 zeta蛋白過表達與他莫昔芬治療乳腺癌耐藥的關系

凌人1，凌今1，2，陳仲華1，劉丹丹1，趙宏圻1，柯友濤1

（1.金華廣福醫院 病理科，浙江 金華 321000；2.復旦大學 藥學院，上海 201203）

目的:探討14-3-3 zeta蛋白過表達與他莫昔芬治療乳腺癌耐藥的關系。方法:采用免疫組織化學S-P法對80例雌激素受體陽性乳腺癌組織中14-3-3 zeta蛋白表達進行檢測，根據14-3-3 zeta蛋白表達情況將患者分組，結合每組生存情況評價14-3-3 zeta蛋白過表達與他莫昔芬治療乳腺癌耐藥的關系。結果:癌組織中14-3-3 zeta蛋白表達總陽性率為96.25%（77/80），其中強陽性占51.25%（41/80），中等陽性占23.75%（19/80），弱陽性占21.25%（17/80）。14-3-3 zeta蛋白過表達與臨床病理因素無明顯相關性。隨訪結果顯示，14-3-3 zeta蛋白過表達組患者在應用他莫昔芬治療后更容易復發，生存期明顯較短。細胞實驗表明，提高乳腺癌細胞中14-3-3 zeta蛋白表達可以增強其對他莫昔芬的耐藥性，反之，抑制14-3-3 zeta蛋白表達可有效提高他莫昔芬治療的敏感性。結論:14-3-3 zeta蛋白可以作為他莫昔芬治療乳腺癌耐藥評估的生物標記物，檢測乳腺癌組織內14-3-3 zeta蛋白表達可以用于評估他莫昔芬治療乳腺癌的療效。

乳腺腫瘤；14-3-3 zeta；免疫組織化學法；他莫昔芬；細胞凋亡

臨床上對于雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性的乳腺癌患者常針對性地選用ER拮抗劑（如他莫昔芬）進行內分泌治療。然而，內分泌治療的有效率僅50%～60%[1-2]。內分泌治療無效的患者往往會因首次治療失敗而錯過最佳治療時機，生存質量和生存時間大打折扣。因此，尋求一種新的生物標記物結合ER表達來更加準確地評估乳腺癌內分泌治療的有效性顯得格外重要。

14-3-3 zeta蛋白是一種細胞信號轉錄蛋白，通過結合磷酸絲氨酸蛋白介導信號轉導，在細胞凋亡中發揮重要作用。本研究應用免疫組織化學方法檢測14-3-3 zeta蛋白在80例激素依賴型乳腺癌組織中的表達，探討其過表達與他莫昔芬治療乳腺癌耐藥的相關性，并通過改變乳腺癌MCF-7細胞株的14-3-3 zeta蛋白表達進一步驗證該蛋白表達與他莫昔芬治療乳腺癌耐藥的相關性，旨在為臨床更加合理地制定診療方案提供科學依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集我院2006至2014年間經手術治療的乳腺癌患者80例作為研究對象，并對其臨床和病理資料進行整理和分析。納入標準:①原發性乳腺癌；②術前未經過任何抗腫瘤治療；③經過2位以上病理科醫師確診；④免疫組織化學重新檢測ER表達為陽性（染色細胞比率大于10%）；⑤使用內分泌治療作為首次治療方案；⑥病例及隨訪記錄完整。研究對象均為女性，平均年齡46±8歲（38～62歲），參照2015年St.Gallen國際乳腺癌大會共識:術后Luminal A型通常僅需內分泌治療，Luminnal B型全部患者均需內分泌治療，大多數要輔助化療，對有淋巴結轉移且直徑在5 cm以上患者予以放療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色:所有標本均經4%中性甲醛固定，常規石蠟切片，HE染色。另取切片，采用免疫組織化學S-P法，鼠抗人14-3-3 zeta單克隆抗體作為一抗，1：100稀釋，參照說明書設置染色程序，并由Leica Bond-Max全自動免疫組織化學染色儀完成。一抗和二抗購自美國Abcam公司，抗體稀釋工作液、DAB顯色試劑盒購自Leica公司。每批染色均設有陽性對照、陰性對照，對照切片出現預期結果的同批染色切片方可進一步讀判。14-3-3 zeta蛋白陽性染色為棕黃色顆粒，主要位于胞漿。免疫組織化學染色的結果判定根據其著色強度×腫瘤細胞陽性率:染色深，且染色細胞比率超過50%者為強陽性染色（+++）；染色強度中等，且染色細胞比率25%～50%者為陽性染色（++）；染色較淺，且染色細胞比率10%～25%者為弱陽性染色（+）；定位處沒有染色，或者染色細胞比率＜10%者為陰性染色（-）。

1.2.2 細胞培養:乳腺癌MCF-7細胞株采用含10%胎牛血清和雙抗的RPMI 1640培養基在37 ℃、5% CO2條件下培養，每2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.3 細胞轉染:將重組質粒DNA經大腸桿菌Ecoli DH5α在含氨芐青霉素的LB培養基中增殖，提純。細胞在轉染前鋪板，使其在轉染時密度為90%～95%時，使用50 μL無血清RPMI 1640培養基稀釋1.0 μg DNA。使用50 μL RPMI 1640培養基稀釋3 μL Lipofectamine 2000試劑（購于Invitrogen公司）。混合上述配置的2種試液，直接將復合物加入到每孔中，搖動培養板，輕輕混勻。在37 ℃，5% CO2培養箱中孵育48 h后，棄去培養液，每孔用2 mL PBS清洗1遍，再用1 mL RPMI 1640清洗2遍，加入不含血清的RPMI 1640培養基繼續培養。24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞內增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的表達情況，采用細胞計數法評價轉染效率。每孔取3個不同的視野分別計數細胞總數和有綠色熒光的細胞數。轉染效率=（發綠色熒光的細胞數/細胞總數）×100%。

1.2.4 RNA干擾:14-3-3 zeta RNA干擾雙鏈siRNA合成序列:14-3-3 zeta特異性序列為5’-AAAGUUCUU GAUCCCCAAUGC-3’，對照序列為5’-CAGUCGCGUUUGCG ACUGG-3’。細胞鋪板生長至1×106后，使用Lipofectamine Plus試劑盒與100 nmol/L的siRNA按照說明書操作進行轉染。

1.2.5 TUNEL凋亡檢測:PBS清洗細胞2次，隨后用4%多聚甲醛固定細胞30～60 min。用PBS清洗細胞，加入含0.1% Triton X-100的PBS冰浴孵育2 min。按末端轉移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）與熒光標記液1：24比例配置TUNEL檢測液，每個樣品加入50 μL，37 ℃避光孵育60 min，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡450 nm波長下觀察，綠色熒光為TUNEL染色陽性細胞。對隨機5個視野下的細胞總數和陽性細胞進行計數，并計算陽性率。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS18.0統計學軟件進行數據分析。計數資料采用卡方檢驗，計量資料采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色結果 14-3-3 zeta表達為胞漿著色，鏡下呈均勻一致的棕黃色顆粒（見圖1），總陽性率為96.25%（77/80），其中強陽性占51.25%（41/80），中等陽性占23.75%（19/80），弱陽性占21.25%（17/80），陰性占3.75%（3/80）。

2.2 生存分析 根據14-3-3 zeta表達強弱將80例患者分為2組，分別記錄其96個月內乳腺復發、轉移、死亡的不良事件發生情況。14-3-3 zeta高表達組共41例患者，觀察期內發生不良事件10例，發生率為24.4%（10/41）；14-3-3 zeta低或中表達組共39例患者，觀察期內發生不良事件2例，發生率為5.1%（2/39）。統計學數據顯示，14-3-3 zeta高表達組患者發生不良事件概率顯著高于14-3-3 zeta低表達組患者（χ2=24.4，P＜0.05）。見圖2。

圖1 乳腺癌組織中14-3-3 zeta蛋白免疫組織化學染色圖（×200）

圖2 14-3-3 zeta過表達與患者內分泌治療后無進展生存期的生存曲線圖

2.3 14-3-3 zeta表達與臨床病理因素的相關性 通過對14-3-3 zeta表達情況與患者各臨床病理因素的統計學分析得出:14-3-3 zeta的表達與患者年齡、患側、病理分級、腫瘤大小、脈管累及、神經累及、Ki67、Her2過表達型均無相關性（P＞0.05），見表1。

2.4 細胞藥敏結果 通過對MCF-7細胞進行轉染，14-3-3 zeta表達水平明顯提高（P＜0.05）（見圖3A）。對于未轉染和轉染14-3-3 zeta基因的MCF-7細胞分別進行他莫昔芬處理72 h。檢測其凋亡水平發現，轉染14-3-3 zeta基因后MCF-7細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），2組差異有統計學意義（見圖3B）。未轉染14-3-3 zeta基因的MCF-7細胞經他莫昔芬處理后凋亡顯著增加（見圖4A），轉染14-3-3 zeta基因的MCF-7細胞經他莫昔芬處理后細胞凋亡不明顯（見圖4B）。隨后，采用合成的siRNA對于MCF-7細胞進行處理，下調14-3-3 zeta基因表達至原表達量的50%（P＜0.05）（見圖5A），再用他莫昔芬處理細胞，結果顯示下調14-3-3 zeta表達量后細胞凋亡顯著增高（見圖5B）。未干擾14-3-3 zeta基因表達的MCF-7細胞經他莫昔芬處理后凋亡較少（見圖6A），干擾下調14-3-3 zeta基因表達的MCF-7細胞經他莫昔芬處理后細胞凋亡顯著增加（見圖6B）。

表1 14-3-3 zeta表達與臨床因素相關性

3 討論

乳腺癌細胞會特異性地表達ER、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor rece-ptor-2，HER2）、Ki-67等多種蛋白[3-4]。以上述這些蛋白作為生物標記物，根據其表達情況可將乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B型、Her2型和基底樣型等4種分子分型。其中，針對ER陽性的Luminal型乳腺癌患者，內分泌治療是首選治療措施。

他莫昔芬是乳腺癌內分泌治療的代表性藥物，它是一種雌二醇競爭性拮抗劑，能與乳腺細胞的雌激素受體結合，不刺激轉錄或作用微弱[5]。理論上來說，他莫昔芬作為一種ER拮抗劑對ER陽性患者均具有療效[6]。然而，由于乳腺癌遺傳異質性基因的存在，激活ER并非唯一的或主要的促進乳腺癌細胞增殖的途徑[7]。這使得應用內分泌治療中，有40%～50%的ER陽性患者對內分泌治療藥物發生耐藥，致使后續的針對性治療變得更為困難[8]。

14-3-3蛋白家族具有高度保守的氨基酸序列，幾乎存在于一切真核生物體內[9]。14-3-3蛋白在人體中存在有7種亞型，其中14-3-3 zeta基因位于2號染色體p25.1區段，含有6個外顯子，表達的14-3-3 zeta蛋白含有245個氨基酸。14-3-3 zeta蛋白缺乏內源性酶活性，主要功能是通過形成二聚體或異質二聚體對目標蛋白的絲氨酸/蘇氨酸位點進行磷酸化而實現的。14-3-3 zeta可以磷酸化MEKK1的調控結構區域，抑制caspase-3對MEKK1 N端調控結構域的作用，阻礙凋亡信號轉導[10-11]。14-3-3 zeta還可以通過對BCL2-associated agonist of cell death（Bad）蛋白Ser136磷酸化阻礙其由細胞漿轉運到線粒體，進而發揮抗凋亡的作用。反之，當細胞分裂周期蛋白2（cell division cycle protein 2，CDC2）磷酸化Bad的Ser128后，14-3-3 zeta則無法磷酸化Bad的Ser136，從而誘導細胞凋亡。研究[12-14]發現，14-3-3 zeta蛋白通過作用于細胞信號轉導，促進多種惡性腫瘤細胞的增殖或抑制細胞凋亡。

圖3 轉染14-3-3 zeta前后MCF-7細胞對他莫昔芬處理的藥敏結果

圖4 14-3-3 zeta轉染MCF-7細胞前后他莫昔芬處理的TUNEL染色圖（×400）

圖5 干擾14-3-3 zeta前后MCF-7細胞對他莫昔芬處理的藥敏結果

圖6 干擾MCF-7細胞內14-3-3 zeta表達前后他莫昔芬處理的TUNEL染色圖（×400）

14-3-3蛋白表達異常可能破壞正常細胞的內穩態，導致腫瘤和其他疾病的發生。比如14-3-3δ是一種腫瘤抑制基因，其表達缺失常見于乳腺癌中。反之，其他14-3-3蛋白在多種癌癥中常表現為高表達，其臨床生物學意義目前已有所發現[15]。DANES等[16]研究表明，乳腺癌早期會發生14-3-3 zeta過表達，其促進人乳腺上皮細胞化生。在約40%晚期乳腺癌患者中會發生14-3-3 zeta高表達，這些患者往往會復發，且生存時間明顯縮短[17]。在這些復發的乳腺癌患者中，僅有小于30%的乳腺癌患者Her2表達陽性，而約有40%的患者14-3-3 zeta表達強陽性。因此，14-3-3 zeta作為一種不良預后的生物標記物會更加準確。本課題組在前期研究中發現[11]，14-3-3 zeta在乳腺癌組織中顯著高表達，統計發現其與臨床病理因素無明顯相關，推測其與腫瘤分化、進展無直接聯系；ER陽性組患者癌組織內14-3-3 zeta蛋白表達顯著高于ER陰性組，提示14-3-3 zeta在乳腺癌中的上調可能受到激素影響，其高表達可能與內分泌治療療效之間存在相關性。本研究對使用他莫昔芬治療的乳腺癌患者癌組織中的14-3-3 zeta蛋白進行檢測，對照其生存情況發現，癌組織中14-3-3 zeta高表達組的患者復發率較14-3-3 zeta低表達組顯著升高。在8年隨訪期里，14-3-3 zeta高表達組中患者的無進展生存率較14-3-3 zeta低表達組低約15%，且差異有統計學意義。此外，14-3-3 zeta的表達與患者臨床資料均不相關，屬于他莫昔芬耐藥的獨立相關因素。本研究數據表明，提高乳腺癌細胞中14-3-3 zeta的表達可以增強腫瘤細胞對他莫昔芬的耐藥性，而降低14-3-3 zeta的表達則有效提高他莫昔芬的敏感性，本研究結果與臨床觀察結果相符。

綜上所述，14-3-3 zeta蛋白高表達促進了乳腺癌細胞對內分泌治療的耐受，下調該基因表達能顯著增強細胞凋亡，提高內分泌治療靈敏度。臨床上觀察，14-3-3 zeta蛋白高表達還預示乳腺癌患者較短的生存期。因此，14-3-3 zeta蛋白高表達可以作為乳腺癌內分泌治療的生物標記物，檢測乳腺癌組織內14-3-3 zeta蛋白表達可準確評估患者預后。

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（本文編輯：吳昔昔）

The relationship between 14-3-3 zeta protein over-expression and tamoxifen resistance in breast cancer

LING Ren1, LING Jin1,2, CHEN Zhonghua1, LIU Dandan1, ZHAO Hongqi1, KE Youtao1.
1.Department of Pathology, Jinhua Guangfu Hospital, Jinhua, 321000; 2.School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai, 201203

Objective:To investigate the relationship between 14-3-3 zeta protein over-expression and tamoxifen resistance in breast cancer.Methods:The 14-3-3 zeta protein expression was detected in the cancerous tissues of 80 breast patients using immunohistochemistry. Based on the follow-up visits, survival status in both high and low 14-3-3 zeta expression groups were analyzed.Results:The total positive ratio of 14-3-3 zeta protein expression in subjects was 96.25% (77/80). Among the total positive ratio, the strong positive ratio, moderate positive ratio and weakly positive ratio were 51.25% (41/80), 23.75% (19/80) and 21.25% (17/80), respectively. The 14-3-3 zeta protein over-expression was related to clinical pathological features. According to the follow-up results, the patients in 14-3-3 zeta high expression group would cause the relapse easily for a short survival time. The results of vitro experiment indicated that the Tamoxifen resistance was enhanced after increasing the expression of 14-3-3 zeta protein. Conversely, the down-regulation of 14-3-3 zeta protein expression would reduce the tamoxifen resistance.Conclusion:As a biomarker of tamoxifen resistance, 14-3-3 zeta protein can be used for evaluating therapeutic eff cacy by detecting its expression in breast cancer tissue.

breast neoplasms; 14-3-3 zeta; immunohistochemistry; tamoxifen; cell apoptosis

R361.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.008

2016-09-21

金華市科技計劃項目（2014-3-088）；浙江省醫藥衛生一般研究計劃項目（2015KYB419）。

凌人（1957-），女，安徽合肥人，副主任醫師。