卵巢去細胞生物支架的制備及鑒定

蘭莉，王嚴，付養華，劉帥良，黎婷，王志斌，習海濤，楊運俊，梅勁

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 超聲科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 放射科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫科大學附屬第一醫院 生殖中心，浙江 溫州 325015；4.溫州醫科大學基礎醫學院 生物支架移植與免疫研究所，浙江 溫州 325035；5.溫州醫科大學附屬第二醫院 生殖中心，浙江 溫州 325027）

卵巢去細胞生物支架的制備及鑒定

蘭莉1，王嚴2，付養華3，劉帥良2，黎婷4，王志斌4，習海濤5，楊運俊2，梅勁4

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 超聲科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 放射科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫科大學附屬第一醫院 生殖中心，浙江 溫州 325015；4.溫州醫科大學基礎醫學院 生物支架移植與免疫研究所，浙江 溫州 325035；5.溫州醫科大學附屬第二醫院 生殖中心，浙江 溫州 325027）

目的:通過浸泡加震蕩法制備豬部分卵巢組織去細胞生物支架，并對其進行鑒定。方法:健康未成年豬卵巢30個，橫切成厚為6 mm的切片，室溫條件下，1% SDS溶液浸泡，同時平板震蕩器震蕩，最后用去離子水清洗其內殘留SDS及DNA碎片。獲得去細胞卵巢生物支架后，對其進行組織化學染色、DNA殘留量定量測定、掃描電鏡檢查及免疫熒光染色，觀察細胞去除情況、支架的三維結構以及細胞外基質中膠原與蛋白質的保留情況。結果:DNA定量分析得出僅15.4%的DNA殘留；HE染色、掃描電鏡及免疫熒光染色提示支架內未見細胞核殘留，并且支架的結構、膠原成分保留較完整。結論:運用浸泡加震蕩法能夠有效地去除卵巢組織中的細胞成分，并且較完整地保持細胞外基質的支架結構，不同程度地保留一些膠原成分及蛋白質。

去細胞；卵巢；組織支架；細胞外基質；卵泡

據統計卵巢早衰在40歲之前發病率為1%，30歲之前發病率約為0.1%[1]。以往文獻報道卵巢癌合計發病率為8.28/10萬，占我國女性惡性腫瘤發病的3.49%[2]。同時其他部位的腫瘤或疾病如乳腺癌、免疫系統疾病等的放療、化療或藥物治療也會不同程度地影響卵巢的功能[3-5]。目前治療卵巢功能部分或完全喪失的手段包括自體或異體卵巢移植及激素替代治療。然而，這些手段都會導致一定的不良后果[6-7]，因此如何修復卵巢損傷和重建卵巢功能，是當前婦科及生殖醫學領域面臨的巨大挑戰。2008年OTT等[8]利用灌注法成功制備小鼠離體心臟去細胞生物支架，并重新注入新生小鼠細胞，體外培養后使心臟復跳，這一研究使體外器官組織再生成為可能。隨后，有不少學者對各器官去細胞化技術進行探索，使之逐漸成為組織工程研究領域的熱點。本研究利用浸泡加震蕩法制備豬卵巢去細胞生物支架，并對其進行鑒定，以期為組織工程和再生醫學提供幫助。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:健康未成年長白豬卵巢取自溫州瑞安市塘下鎮一屠宰場。

1.1.2 主要試劑:十二烷基硫酸鈉（SDS）；小鼠來源

I型膠原抗體（英國Abcam ab6308）；小鼠來源纖維粘連蛋白抗體（fibronectin，FN，英國Abcam ab6328）；兔來源IV型膠原抗體（英國Abcam ab6586）；兔來源層粘連蛋白抗體（Laminin，LN，英國Abcam ab11575）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）；HE染色液（美國Invitrogen公司）；DNA試劑盒（美國Omega公司）。

1.2 方法

1.2.1 去細胞卵巢生物支架的制備:卵巢離體后均放入肝素生理鹽水中浸泡3～4 h，然后放入-80 ℃冰箱中保存。每個卵巢橫切成2～3個厚為6 mm的組織塊，留取一塊作為正常對照組，其余為實驗組，然后浸入濃度為1%的SDS溶液中，同時放在平板震蕩器上震蕩，轉速為120 r/min，保持溫度為20～25 ℃。間斷換液，36 h后將SDS換成去離子水，繼續震蕩，以清洗里面殘留的DNA及SDS。

1.2.2 去細胞卵巢生物支架的鑒定:①大體觀察及HE染色:觀察去細胞過程中0、4、8、12、20、28及36 h 7個時間點卵巢的顏色及形態變化；去細胞支架及正常對照組用4%多聚甲醛4 ℃固定24 h以上，用酒精梯度脫水、二甲苯透明，石蠟包埋后切成5 μm厚度切片，脫蠟后行HE染色。②DNA殘留量測定:卵巢支架及相應的正常對照組織小塊用真空凍干器凍干過夜、稱重；按照DNA試劑盒中的說明進行DNA的提取，然后利用分光光度計測量OD值后進行計算，分別測出每個支架及正常組織的DNA含量（ng/mg）。③掃描電鏡:支架及正常對照組織用2.5%戊二醛4 ℃固定，切成6～9 mm3小塊；0.9%氯化鈉溶液清洗3次，每次15 min；鋨酸固定1 h；70%、80%、90%酒精梯度脫水，每個梯度15 min，再用100%酒精脫水2次，每次15 min；臨界點干燥儀干燥40 min后貼在黏附有碳帶的銅片上，然后抽去真空，用真空鍍膜儀鍍膜噴金，用掃描電鏡觀察組織三維結構。④免疫熒光:組織4%多聚甲醛4 ℃固定24 h，20%蔗糖脫水2 d后換成30%蔗糖繼續脫水2 d以上。OCT包埋，切片，支架為12 μm厚，正常組織為10 μm厚。所有一抗均按1：200比例稀釋，二抗也以同樣比例稀釋；熒光顯微鏡觀察其內膠原表達及分布，DAPI染色判斷有無細胞核殘留。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS20.0軟件進行統計學分析。計量資料均以±s表示，2組間比較用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 去細胞支架與正常組織的HE染色比較 隨著去細胞時間的延長，卵巢組織切片的顏色逐漸變白、變透，而且體積也慢慢變得飽滿，見圖1A。HE染色示所有的支架均未見明顯藍染的細胞核成分，細胞外基質中的膠原成分紅染。不同發育階段的卵泡大體結構完整，血管腔仍然存在，見圖1B-E。

2.2 去細胞支架與正常組織的DNA殘留量比較 去細胞支架內殘留DNA量為（214.97±21.47）ng/mg，遠低于正常組織內的含量（1 394±317.05）ng/mg（P＜0.01）；去細胞支架內DNA殘留量占正常組織中的15.4%，見圖2和表1。

2.3 去細胞支架與正常組織的掃描電鏡比較 正常組織三維結構完整，可以觀察到細胞突起，卵泡腔內可以見到松散的卵丘細胞團；去細胞支架三維結構完整，卵泡壁完整，血管腔結構連續，高倍鏡下膠原纖維遍布細胞外基質且未見明顯斷裂，見圖3。

2.4 去細胞支架與正常組織的免疫熒光比較 正常組織及去細胞支架內均可見到IV型膠原陽性表達，主要分布于卵泡壁周圍，見圖4A-D（白色箭頭）；I型膠原無論在去細胞支架還是在正常組織中都廣泛分布在卵巢間質中，且呈條帶樣，但在卵泡壁上僅見模糊表達，見圖4E-F（紅色箭頭）；LN主要分布在皮質區卵泡壁周圍，尤其是較小的卵泡，見圖4G-H（黃色箭頭）；FN在卵巢間質中有陽性表達，但含量較少，見圖4J-K（藍色箭頭）。DAPI染色正常組織中細胞核布滿整個視野，而去細胞支架中未見明顯陽性表達，見圖4M-N。

圖1 卵巢去細胞過程大體觀察及HE染色

圖2 去細胞支架和正常組織內DNA含量曲線圖

表1 去細胞支架與正常組織DNA含量對比（n=5，±s）

表1 去細胞支架與正常組織DNA含量對比（n=5，±s）

與正常組織比:aP＜0.01

圖3 去細胞支架和正常組織的掃描電鏡觀察

3 討論

去細胞生物支架是利用化學法、機械法或灌注法將組織或器官中的所有細胞去除，只保留細胞外基質及其三維結構的一種組織工程材料。因為去除了大部分細胞，大大降低了免疫排斥反應，所以較人工組織或器官更具生物相容性[9]。近年來，去細胞生物支架已實現于多種組織或器官，而應用于卵巢者僅見一篇文獻報道，且實驗對象是牛[7]。不同的組織器官，去細胞的方法也不盡相同，如腎臟、肝臟、肺、胰腺及心臟[10-14]等血供豐富的器官多采用灌注法，而脊髓[15]則采用震蕩法。在本實驗中利用陰離子去污劑SDS浸泡加平板震蕩器震蕩，對SDS的作用濃度、作用時間等條件進行反復摸索，成功制備了卵巢去細胞生物支架，并且對其特征進行了一系列鑒定。-80 ℃儲存的卵巢避免反復凍融，因為SOLEIMANI等[16]研究表明反復凍融會影響卵泡的生存，且對蛋白質的結構有一定的破壞。嚴格控制組織厚度、換液時間及實驗溫度則是盡量控制SDS去細胞作用的影響因素。本實驗中雖然DNA含量未達到支架的標準，即50 ng/mg[17]，但是殘留率（為15.4%）較文獻中的15.01%基本相當[7]，而在該文獻中已經證實無明顯的免疫排斥反應。

組織或器官的三維結構對于細胞的黏附、遷徙具有重要作用[18]；而細胞外基質中的蛋白質組成成分對于組織器官的生理病理過程有重要影響。LU等[19]研究表明成釉蛋白細胞外基質分子能夠加強骨折阻力，并能促進骨折的快速愈合；LI等[20]研究表明Yes蛋白的表達下調與主動脈瘤中細胞外基質紊亂密切相關。本實驗中掃描電鏡顯示卵巢支架的三維結構保存較完整；免疫熒光顯示細胞外基質中的膠原及蛋白質有陽性表達，這些無疑為后面的研究打下了堅定基礎。

目前干細胞與支架的共培養以及支架與化學試劑的交聯是在去細胞生物支架上發展起來的兩大熱點[21-26]。將干細胞種植在支架上，能夠誘導干細胞朝著組織細胞分化，甚至部分或完全恢復器官的功能，起到器官再生的作用；將支架與化學試劑交聯，再包埋于體內，能夠減緩支架的降解，提高支架的機械強度。

圖4 去細胞支架和正常組織的免疫熒光染色圖（×100）

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（本文編輯：吳彬）

Preparation and identification of ovarian decellularized biologic scaffold

LAN Li1, WANG Yan2, FU Yanghua3, LIU Shuailiang2, LI Ting4, WANG Zhibin4, XI Haitao5, YANG Yunjun2, MEI Jin4.
1.Department of Ultrasound, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Radiology, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 3.Department of Reproductive Center, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 4.Institute of Bioscaffod Transplantation and Immunology, Basic Medical College of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 5.Department of Reproductive Center, the Second Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To prepare decullularized biologic scaffolds of part of porcine ovarian tissue by soaking with rotating, and then indentify their characteristics.Methods:Thirty ovaries were excised from healthy immature pigs, and then cut transversely into pieces at the thickness of 6 mm uniformly. At room temperature, they were soaked into 1% SDS solutions and rotated on a tablet oscillator at the speed of 120 r/min for 36 h. At last they were washed with deionized water to get rid of residual SDS and DNA fragments. After decellularization, histochemical staining was done, the residual DNA was quantitative determined, examined under scanning electron microscope examination and did immunof uorescence to observe the removal of cells, the three-dimensional structure of the scaffolds, and the reservation of collagens and proteins in the extracellular matrix.Results:Quantitative analysis showed that only 15.4% DNA remained in the decellularized scaffolds compared to the normal control tissues; HE straining, scanning electron microscope and immunof uorescence showed there were no cells left in the scaffolds, at the same time, the three-dimensional structure and the collagens in the extracellular matrix kept intact. Conclusion:The method of soaking with rotating can remove all cells from the ovarian tissue, maintain the supporting structure of extracellular matrix relatively completely, and reserve collagens and proteins at a certain degree.

decellularization; ovary; tissue scaffolds; extracellular matrix; ovarian follicle

R322.6

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.006

2016-11-01

浙江省自然科學基金資助項目（LQ16H040002）。

蘭莉（1975-），女，湖北武漢人，主治醫師，碩士。

梅勁，副教授，碩士生導師，Email:tibetcn@email.com。