Rab11-FIP4對結(jié)腸癌細胞生物學特性的影響

楊守醒，俞耀軍，王建嶂，鄭波，薛戰(zhàn)雄，徐昌隆

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.消化內(nèi)科；2.胃腸外科）

Rab11-FIP4對結(jié)腸癌細胞生物學特性的影響

楊守醒1，俞耀軍2，王建嶂1，鄭波1，薛戰(zhàn)雄1，徐昌隆1

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.消化內(nèi)科；2.胃腸外科）

目的:探討Rab11-FIP4的表達變化對結(jié)腸癌細胞生物學特性的影響。方法:采用結(jié)腸癌細胞株HCT116轉(zhuǎn)染Rab11-FIP4特異性siRNA干擾Rab11-FIP4表達。用Western blot實驗檢測干擾效率。運用CCK-8實驗和Transwell實驗分別檢測干擾Rab11-FIP4對結(jié)腸癌細胞株HCT116增殖和運動能力的影響。結(jié)果:siRNA轉(zhuǎn)染使Rab11-FIP4表達量從100.2±21.5降低至23.5±5.8，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。干擾Rab11-FIP4后結(jié)腸癌細胞株HCT116的體外增殖明顯下降，第2天的抑制率為29.40%，差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），第3天的抑制率為37.65%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結(jié)腸癌細胞的遷移數(shù)從193.4±22.1降至113.9± 12.7，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），細胞侵襲數(shù)從113.3±16.7降至66.5±6.7，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論:干擾Rab11-FIP4的表達能抑制結(jié)腸癌細胞的體外增殖、遷移和侵襲能力，Rab11-FIP4可能在結(jié)腸癌的進展中發(fā)揮重要作用。

Rab11-FIP4；結(jié)腸腫瘤；RNA，小分子干擾；細胞增殖；細胞運動；腫瘤侵潤

Rab11-FIP4（Rab11-family interacting protein 4）是小G蛋白Rab11相互作用蛋白家族（Rab11 family interacting proteins，Rab11-FIPs）中的一員，其C末端含有一個同源的Rab11結(jié)合區(qū)（Rab11 binding domain，RBD），屬于第二類Rab11-FIPs亞家族[1]。Rab11-FIP4主要定位于細胞內(nèi)的再循環(huán)內(nèi)體、高爾基體反面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其與Rab11結(jié)合后參與調(diào)控胞內(nèi)囊泡運輸和胞質(zhì)的分裂過程。近期有研究顯示，Rab11-FIP4可通過調(diào)控mTOR/PRAS40信號通路影響細胞性肝癌的進展[2]。但迄今關(guān)于Rab11-FIP4在結(jié)腸癌中的表達及其作用尚未見報道。

本研究檢測結(jié)腸癌細胞株HCT116中Rab11-FIP4的表達，隨后轉(zhuǎn)染Rab11-FIP4特異性siRNA干擾其表達，檢測干擾效率，并運用Cell counting kit-8（CCK-8）實驗和Transwell實驗分別檢測干擾后對結(jié)腸癌細胞株HCT116增殖、遷移和侵襲能力的影響，以探討Rab11-FIP4在結(jié)腸癌中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 結(jié)腸癌細胞株HCT116購自中國科學院細胞庫，高糖DMEM（Dulbecco’s modified eagle’s medium）培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司，siRNAs購自上海拓然生物公司，CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司，Transwell小室購自美國BD Biosciences公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):結(jié)腸癌細胞株HCT116用含10% FBS、100 ng/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)液于5% CO2和37 ℃條件下培養(yǎng)，細胞生長至80%～90%融合度時進行傳代。

1.2.2 Western blot實驗:生長狀態(tài)良好的細胞加入細胞裂解液，置冰上裂解細胞，用細胞刮刀收集細胞裂解液，4 ℃ 12 000 r/min離心后收集上清備用。配制SDS-聚丙烯酰胺分離膠，各泳道加入等量蛋白樣品，用Electrophoresis power supply（Bio-Rad）電泳儀進行電泳。蛋白轉(zhuǎn)膜后，將轉(zhuǎn)印有蛋白質(zhì)的硝酸纖維素濾膜在適量的封閉液中室溫封閉。一抗雜交液4 ℃孵育過夜。次日用含0.02% Tween-20的PBS室溫漂洗濾膜，加入以封閉液配制的辣根過氧化物酶（HRP）標記的相應二抗的雜交液，室溫下在平穩(wěn)搖床上孵育。使用SuperSignal West Pico化學發(fā)光試劑盒進行檢測。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染實驗:轉(zhuǎn)染前1 d，接種適當數(shù)量的細胞至6孔板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基。siRNA轉(zhuǎn)染干擾Rab11-FIP4為實驗組，未進行siRNA轉(zhuǎn)染為對照組。siRNA轉(zhuǎn)染實驗步驟如下:①用200 μL不含F(xiàn)BS培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋5 μL的siRNA儲存液（20 mmol/L），輕輕混勻，室溫孵育5 min；②用200 μL不含F(xiàn)BS培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋5 μL lipo2000，輕輕混勻并室溫孵育5 min；③將兩者輕輕混勻，室溫孵育20 min；④將siRNA-lipo2000混合液加入細胞密度為30%～50%的6孔板內(nèi)，同時加入400 μL無FBS培養(yǎng)基，輕輕混勻；⑤培養(yǎng)約6 h后，棄去孔內(nèi)含siRNA-lipo2000混合液的培養(yǎng)基；⑥更換完全培養(yǎng)基，將6孔板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；⑦轉(zhuǎn)染完成后48～72 h進行siRNA沉默效果檢測和細胞功能檢測。

1.2.4 CCK-8實驗:96孔板每孔種植4 000個細胞，培養(yǎng)0、24、48、72 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，檢測450 nm波長吸收值。分別對實驗組和對照組進行檢測。

1.2.5 Transwell實驗:①細胞遷移實驗:Transwell內(nèi)室接種200 μL細胞懸液（含50 000個細胞），每個Transwell外室中加800 μL含20%～30% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。取出小室后，棄去內(nèi)室的殘余培養(yǎng)基，并用棉簽擦凈內(nèi)室濾膜上的細胞，用含0.1%結(jié)晶紫和20%甲醇的PBS對小室染色30 min。用棉簽擦凈小室內(nèi)表面和濾膜，倒置顯微鏡下觀察小室濾膜上的細胞并計數(shù)（200×倍鏡下隨機選擇5個視野并計數(shù)），同類實驗至少重復3次。②細胞侵襲實驗:提前將貯存于-20 ℃的Matrigel基質(zhì)膠置于4 ℃解凍，當其由凝固狀態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時，用預冷的無血清DMEM將Matrigel基質(zhì)膠按1：6比例混合置于冰上備用；取80 μL稀釋好的Matrigel基質(zhì)膠均勻鋪在Transwell小室內(nèi)膜上，37 ℃放置約4 h，確保去凝成膠體。其余實驗過程同細胞遷移實驗。以上實驗分別對實驗組和對照組進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 應用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學分析。所有計量資料用±s表示，采用獨立樣本t檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染后Rab11-FIP4的表達情況 Western blot結(jié)果顯示，實驗組siRNA轉(zhuǎn)染后Rab11-FIP4的產(chǎn)物條帶灰度明顯低于對照組，Rab11-FIP4表達從100.2±21.5降低至23.5±5.8，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。

2.2 干擾Rab11-FIP4抑制結(jié)腸癌細胞的體外增殖能力 CCK-8實驗顯示，干擾Rab11-FIP4的表達后，結(jié)腸癌細胞株HCT116的體外增殖明顯下降，第2天的抑制率為29.40%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），第3天的抑制率為37.65%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 干擾Rab11-FIP4抑制結(jié)腸癌細胞的體外遷移和侵襲能力 細胞遷移實驗結(jié)果顯示，干擾Rab11-FIP4后，結(jié)腸癌細胞的遷移數(shù)從193.4±22.1降至113.9±12.7，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3A。細胞侵襲實驗結(jié)果顯示，干擾Rab11-FIP4后細胞侵襲數(shù)從113.3±16.7降至66.5±6.7，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3B。

圖1 Western blot檢測siRNA轉(zhuǎn)染后Rab11-FIP4的表達變化

圖2 CCK-8實驗分析細胞增殖變化

3 討論

圖3 Transwell實驗檢測干擾Rab11-FIP4后細胞遷移和侵襲能力的變化（×200）

癌基因的表達上調(diào)或抑癌基因的缺失是驅(qū)動腫瘤侵襲和遠端轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，而在絕大多數(shù)類型的腫瘤（包括結(jié)腸癌）中轉(zhuǎn)移是導致腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[3]。由于轉(zhuǎn)移的存在，手術(shù)切除和藥物治療后結(jié)腸癌患者的存活率依然很低[4]。迄今，參與調(diào)控結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵機制尚未闡明。有研究顯示，過表達Rab11-FIP4可以促進肝癌細胞的體外運動侵襲能力以及體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力[2]。但關(guān)于Rab11-FIP4在其他類型實體瘤中是否有同樣的功能尚不清楚。本實驗通過轉(zhuǎn)染特異靶向性siRNA干擾Rab11-FIP4的表達可顯著抑制結(jié)腸癌細胞株HCT116的體外增殖、遷移和侵襲能力，提示Rab11-FIP4在結(jié)腸癌的進展中發(fā)揮重要作用。

Rab11是Rab小分子GTP酶家族的一個亞家族成員，活化狀態(tài)的Rab11與GTP結(jié)合，通過識別其效應分子從而執(zhí)行各種功能。執(zhí)行完功能后Rab11在GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）的參與下水解GTP進而轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的Rab11-GDP[1]。Rab11的生物學功能主要包括調(diào)節(jié)再循環(huán)內(nèi)體的形成與運輸，調(diào)控細胞膜受體和黏附分子的循環(huán)再利用過程，如AMPA受體、EGF受體、Toll樣受體4、α5β1整合素、E-cadherin和N-cadherin等[5-7]。Rab11-FIPs蛋白家族成員的特點是它們的C末端含有一個同源的RBD，RBD能夠高度特異地識別Rab11-GTP。有多項研究結(jié)果顯示，Rab11-FIPs可以與Rab11相互作用，如FUKUDA等[8]報道Rab14和Rab11-FIP2相互作用，LALL等[9]研究發(fā)現(xiàn)所有的Rab11成員均可以與Rab14和I型FIPs（RCP、FIP2和Rip11）相互作用。此外，Rab11-FIP2、Rab11-FIP2以及Rab11可以形成復雜的復合體結(jié)構(gòu)[10-12]。有研究顯示，Rab11-FIP4不僅其C末端含有一個同源的Rab11結(jié)合區(qū)，其N末端還具有特征性的EF hand和脯氨酸富含區(qū)[13]。迄今Rab11-FIP4在結(jié)腸癌中的作用是否通過Rab11尚待深入研究。有研究報道，在肝癌中缺氧微環(huán)境可以通過HIF1α上調(diào)Rab11-FIP4的表達，然后Rab11-FIP4調(diào)控mTOR/PRAS40信號通路影響肝細胞肝癌的進展[2]。另有研究報道，Rab11-FIP4不僅能與Rab11直接結(jié)合，還可與小分子GTP酶家族的另一成員Arf6/Arf5結(jié)合，參與細胞的膜泡運輸過程[14-15]。在結(jié)腸癌中，Rab11-FIP4是否也存在類似的調(diào)控機制，值得進一步的研究。

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（本文編輯：賈建敏）

The influence of Rab11-FIP4 in cytological characteristics of colorectal cancer

YANG Shouxing1, YU Yaojun2, WANG Jianzhang1, ZHENG Bo1, XUE Zhanxiong1, XU Changlong1.
1.Department of Gastroenterology, the Second Aff liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Gastrointestinal Surgery, the Second Aff liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To investigate the effects of Rab11-FIP4 on cytological characteristics of colorectal cancer (CRC).Methods:Western blot was used to detect the expression of Rab11-FIP4 in CRC cell line HCT116, which was transfected with siRNAs that specifically targeting Rab11-FIP4. Proliferation and migration of HCT116 cells were analyzed by CCK-8 assay and Transwell assay.Results:Rab11-FIP4 by siRNA transfection expressing in 100.2±21.5 reduced to 23.5±5.8 (P＜0.01). Interference Rab11-FIP4, CRC cell line HCT116 in vitro, proliferation decreased obviously, the second day of the inhibition rate was 29.40%, the inhibition rate of 37.65% on the third day (P＜0.05), number of cells migrating from 193.4±22.1 to 113.9±12.7 (P＜0.05) and cell invasion number from 113.3±16.7 to 66.5±6.7 (P＜0.05).Conclusion:Knockdown of Rab11-FIP4 signif cantly inhibits proliferation, migration and invasion of CRC cells in vitro, indicating its important role in CRC progression.

Rab11-FIP4; colonic neoplasms; RNA, small interfering; cell proliferation; cell movement; neoplasm invasiveness

R735.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.004

2016-11-07

浙江省自然科學基金資助項目（LY16H160055）；溫州市科技計劃項目（Y20150156）。

楊守醒（1992-），男，浙江溫州人，碩士生。

徐昌隆，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導師，Email: xchlong@163.com。