SIAH2與MMP2在非小細胞肺癌中的表達及其意義

楊志強，溫媛媛，李略

（舟山醫院 呼吸內科，浙江 舟山 316021）

SIAH2與MMP2在非小細胞肺癌中的表達及其意義

楊志強，溫媛媛，李略

（舟山醫院 呼吸內科，浙江 舟山 316021）

目的:研究SIAH2與金屬基質蛋白酶2（MMP2）在人非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達，并分析其與肺癌臨床病理特征的關系。方法:采用免疫組織化學S-P法檢測120例NSCLC石蠟包埋組織中SIAH2與MMP2蛋白的表達情況，分析其表達與臨床病理因素之間的相關性。采用脂質體介導法將SIAH2干擾片段SIAH2 siRNA轉染入肺癌細胞系A549和SK-MES-1后，利用RT-PCR和Western blot法檢測SIAH2與MMP2在mRNA和蛋白水平的表達情況。干擾SIAH2表達后，應用MTT法、Transwell法檢測SIAH2對肺癌細胞增殖和侵襲的影響。結果:SIAH2與MMP2在NSCLC中高表達，其高表達與肺癌高TNM分期（P=0.019，P=0.020）、低分化（P=0.024，P=0.011）和淋巴結轉移（P=0.032，P=0.021）顯著相關。SIAH2與MMP2在NSCLC中表達呈正相關（r=0.321，P＜0.01），SIAH2與MMP2在肺癌細胞系中高表達。干擾SIAH2表達后，與未處理組及轉染對照片段control siRNA組相比，SIAH2與MMP2的mRNA（P＜0.05）和蛋白（P＜0.05）表達均明顯下降，細胞生長增殖能力[P＜0.01（2～4 d）；P＜0.01（2～4 d）]減弱，細胞侵襲數目（17.61±4.34；20.12±5.43）（P＜0.05）減少。結論:高表達SIAH2在NSCLC的惡性進程中起重要作用，MMP2可能參與了此惡性表型的形成過程。

癌，非小細胞肺；SIAH2；金屬基質蛋白酶2；增殖；侵襲

SIAH（seven in absentia homolog）家族蛋白是果蠅屬SINA蛋白的同系物，人類有2個高度保守的同源SIAH:SIAH1與SIAH2。siah2基因定位于3q25號染色體，編碼324個氨基酸，其蛋白產物是一種環指泛素連接酶，在其N端有環形催化結構域（ring finger domain，RFD），C端有底物結合結構域（substrate binding domin，SBD），它們之間有2個鋅指結構[1]。SIAH2與惡性腫瘤的發生發展密切相關。研究表明，SIAH2在口腔鱗狀細胞癌[2]、卵巢癌[3]、胰腺癌[4]、乳腺癌[5]和肝癌[6]中均高表達。

腫瘤的侵襲轉移與細胞外基質的降解和金屬基質蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）密切相關，MMP2作為MMPs的重要組成成員在腫瘤侵襲轉移中發揮重要作用。研究發現，MMP2在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的表達明顯高于癌旁正常組織，且與淋巴結轉移和臨床分期呈正相關[7]。MMP2在肝癌中高表達，且與肝癌細胞侵襲轉移有關[8]。MMP2在喉癌患者中高表達，與喉癌不良預后相關[9]。

SIAH2與MMP2在腫瘤中的相互關系尚未見報道。本研究擬采用免疫組織化學法、免疫印跡法及RTPCR法檢測SIAH2與MMP2在NSCLC組織和細胞中的表達情況，分析其表達的相關性及其與肺癌患者臨床病理因素之間的關系。采用RNA干擾技術，觀察沉默siah2基因表達后，對NSCLC細胞增殖和侵襲能力的影響以及MMP2的表達情況，探討SIAH2與MMP2在肺癌發生發展中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 收集浙江省舟山醫院病理科2005年至2012年原發性NSCLC患者手術切除標本存檔蠟塊120例，所有患者術前均未接受放、化療。其中男66例，女54例。年齡33～76歲（中位年齡57歲）。按WHO（2010）組織學分類標準:鱗狀細胞癌53例，腺癌67例。按國際抗癌聯盟（UICC）2002年修訂的TNM分期標準:I期40例，I I期28例，I I I期39例，IV期13例。淋巴結轉移61例，無淋巴結轉移59例。標本均經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，HE常規染色后明確診斷。所有標本的使用均通過了本院倫理委員會審核且患者本人知情同意。

1.2 主要試劑 免疫組織化學S-P檢測試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒（DAB-0031，福州邁新生物技術公司）；鼠抗人SIAH2抗體、鼠抗人MMP2抗體、SIAH2 siRNA（美國Santa Cruz公司），β-actin抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；DMEM培養液、胎牛血清（美國Gibco公司）；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，美國Sigma公司）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒（大連TaKaRa公司），PCR引物合成與測序委托大連TaKaRa公司進行。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色及結果判定:組織經中性福爾馬林固定、石蠟包埋，制成4 μm連續切片。按照免疫組織化學S-P檢測試劑盒說明書步驟進行SIAH2（1：200）和MMP2（1：150）免疫組織化學染色。PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。SIAH2和MMP2判定標準:SIAH2以細胞核中出現棕黃色顆粒為陽性顯色，MMP2以細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性顯色。每張切片隨機選取5個高倍視野（×400），每高倍視野計數100個目的細胞。將表達陽性率分為以下4個等級:≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分。根據免疫組織化學染色強度分為3個等級:無著色計為0分，淺黃色顆粒計為1分，棕黃色顆粒計為2分。以SIAH2或MMP2表達陽性率和染色強度的分值乘積作為總積分，積分≥3分者判定為陽性，積分＜3分者判定為陰性。

1.3.2 細胞培養:人正常支氣管上皮細胞系（HBE）、人肺腺癌細胞系（A549、Lu165）、人肺鱗癌細胞系（SK-MES-1、NCI-H520）、人肺巨細胞癌細胞系（PGLH7）6種細胞均為貼壁生長的細胞系，均接種在DMEM培養基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）中，于37 ℃含5% CO2濕潤空氣的培養箱中培養。

1.3.3 RNA干擾:使用脂質體Lipofectamine 2000將siRNA導入肺癌細胞系A549與SK-MES-1中（具體步驟按試劑說明書進行）。陰性對照組分未轉染組和control siRNA轉染組。轉染48 h后進行后續Western blot和RT-PCR檢測。

1.3.4 Western blot:收集細胞，加入裂解液，4 ℃靜置24 h，低溫高速離心（4 ℃，12 000 r/min，40 min），提取上清即為總蛋白。經電泳、轉印，5%正常小牛血清封閉，抗SIAH2（1：500）、抗MMP2（1：400）和抗β-actin（1：500）4 ℃下孵育，過夜；二抗于室溫下孵育2 h；ECL顯色，X線膠片曝光成像，經自動電泳凝膠成像分析儀采集圖像。

1.3.5 RT-PCR:采用Trizol試劑提取細胞總RNA，利用RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒反轉錄獲得cDNA，擴增SIAH2和MMP2，以β-actin為內參。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后成像分析。SIAH2PCR上游引物:5’-ATGGGAACCTTGGAATCAATG-3’；下游引物:5’-CACAGAACCACCTCCGAATTA-3’。MMP2 PCR上游引物:5’-GGCCTCTCCTGACATTGACCTT-3’；下游引物: 5’-GGCCTCGTATACCGCATCAATC-3’。β-actin PCR上游引物:5’-CGGCATTGTCAGCAACTG-3’；下游引物:5’-CGC TCGGTCAGGATCTTC-3’。

1.3.6 MTT法:將單個細胞懸液分別接種于96孔培養板中，每孔含1×104個細胞，培養24 h，每孔加入MTT溶液繼續培養4 h，加入DMSO，490 nm波長下測定各孔吸收值，以不含細胞的等體積培養基作對照，繪制細胞生長曲線。

1.3.7 基質膠侵襲實驗（Transwell侵襲小室測定）:在Transwell侵襲小室上室加入100 μL預冷的Matrigel基質膠（按基質膠與無血清DMEM培養基1：7稀釋），下室中加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養基，將轉染后24 h的肺癌細胞接種到上室，并于37 ℃含5% CO2孵箱中培養32 h后吸盡培養基，PBS清洗后，甲醇室溫下固定15 min，用棉簽擦掉微孔膜上表面的細胞，蘇木素染色，室溫干燥過夜。取下微孔膜，置載玻片上，顯微鏡下計數侵襲至濾膜下表面的細胞數，每張濾膜隨機計數10個視野（×400），取均值。實驗重復3次。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS13.0統計學軟件進行統計分析。計量資料用±s表示，免疫組織化學染色結果采用pearson Chi-Square檢驗；RT-PCR、Western blot、MTT和細胞侵襲實驗結果均采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SIAH2與MMP2蛋白在NSCLC組織中的表達 SIAH2與MMP2蛋白在NSCLC組織中高表達，且與肺癌的低分化、高TNM分期和淋巴結轉移相關。免疫組織化學結果顯示，在120例NSCLC石蠟標本中，SIAH2在84例（占70.0%）肺癌標本中呈核表達強陽性，MMP2在91例（占75.8%）肺癌標本中呈現胞質強陽性。在人肺正常支氣管黏膜上皮細胞中，SIAH2與MMP2蛋白表達陰性或弱陽性，見圖1。對120例NSCLC中SIAH2和MMP2表達進行相關性分析，spearman相關性檢驗結果顯示，SIAH2與MMP2表達呈正相關（r= 0.321，P＜0.01），見表1。

圖1 SIAH2與MMP2在NSCLC中的表達（SP，×200）

表1 120例NSCLC組織標本中SIAH2和MMP2蛋白表達的相關性

進一步分析120例NSCLC組織中SIAH2與MMP2蛋白表達與臨床病理因素之間的關系發現，SIAH2和 MMP2的高表達與肺癌的低分化（P=0.024，P=0.011）、高TNM分期（P=0.019，P=0.020）及淋巴結轉移顯著相關（P=0.032，P=0.021）。其中，在54例低分化病例中有49例（占90.7%）SIAH2和50例MMP2（占92.4%）高表達；I I I～IV期病例中有48例（占92.3%）SIAH2和47例（占90.4%）MMP2存在高表達；在伴有淋巴結轉移的病例中，53例（占86.9%）SIAH2與54例（88.5%）MPP2存在高表達。SIAH2與MMP2的高表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小和組織學類型無明顯相關性（P＞0.05），見表2。

2.2 SIAH2與MMP2在肺癌細胞系中高表達 RT-PCR和Western blot結果顯示，SIAH2與MMP2 mRNA和蛋白在人肺腺癌細胞系（A549、Lu165）、人肺鱗癌細胞系（SK-MES-1、NCI-H520）、人肺巨細胞癌細胞系（PGLH7）表達高于正常支氣管上皮細胞系（HBE）（P＜0.05），見圖2。

表2 120例NSCLC中SIAH2和MMP2的表達與臨床病理學參數之間的關系[ n（%）]

圖2 SIAH2與MMP2在肺正常支氣管上皮細胞系與肺癌細胞系中的表達

2.3 沉默SIAH2表達后SIAH2與MMP2 mRNA和蛋白表達均下調 在肺癌細胞系A549與SK-MES-1中瞬時轉染SIAH2 siRNA 48 h后，RT-PCR和Western blot結果顯示，與未處理組及control siRNA組比較，2種肺癌細胞中SIAH2 mRNA和蛋白表達均顯著下調，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖3，證明實驗所采用的SIAH2 siRNA干擾效果是確定的。同時在轉染SIAH2 siRNA 48 h后，RT-PCR和Western blot檢測到MMP2 mRNA和蛋白表達也顯著下調（P＜0.05），見圖3。

圖3 干擾SIAH2表達后SIAH2與MMP2在肺癌細胞系中的表達情況

2.4 沉默SIAH2表達可抑制肺癌細胞的侵襲 Transwell實驗結果表明，肺腺癌細胞系A549與肺鱗癌細胞系SK-MES-1轉染SIAH2 siRNA（17.61±4.34；20.12±5.43）后侵襲細胞數與control siRNA組（126.16±15.41；150.32±23.44）和未處理組（118.45±10.36；138.76±18.63）比較明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 干擾SIAH2表達后A549與SK-MES-1細胞侵襲數目明顯減少

2.5 沉默SIAH2表達可抑制肺癌細胞的增殖 MTT實驗結果表明:在肺癌細胞系A549和SK-MES-1中轉染SIAH2 siRNA 1 d后，與control siRNA組或未處理組比，細胞相應的吸光度值無明顯改變（P＞ 0.05）。但在轉染SIAH2 siRNA 2～4 d后，細胞吸光度值較第1天有明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01）（見圖5A、B）。以上結果提示:沉默SIAH2表達可顯著抑制肺癌細胞的增殖能力。

圖5 干擾SIAH2表達后，肺癌細胞系A549與SK-MES-1細胞增殖能力減弱

3 討論

有研究[10]報道，SIAH2在乳腺癌中高表達，與臨床分期呈正相關，且與乳腺癌惡性程度和腫瘤進展密切相關。GAO等[3]采用免疫組織化學研究發現，在122例卵巢癌中SIAH2高表達，與卵巢癌的組織學分級和淋巴結轉移呈正相關，這提示SIAH2與卵巢癌的發生發展及惡性進程相關。SIAH2在肺鱗狀細胞癌中高表達，隨著肺癌的惡性進展表達增高，且可通過增加TYK2的蛋白酶降解途徑來抑制STAT3通路的活性[11]。本研究免疫組織化學結果發現在120例NSCLC石蠟標本中，SIAH2在NSCLC組織中高表達，且SIAH2高表達與肺癌的低分化、高TNM分期和淋巴結轉移顯著相關。RT-PCR與Western blot結果發現，SIAH2在NSCLC細胞中表達明顯高于正常支氣管黏膜上皮細胞。這些研究結果提示高表達SIAH2在NSCLC的惡性進展中起重要作用。

沉默SIAH2表達可抑制肺癌細胞增殖、促進細胞凋亡與抑制裸鼠成瘤[12]。抑制SIAH2泛素連接酶可阻止惡性黑色素腫瘤形成[13]。干擾SIAH2表達可通過p53依賴途徑來抑制細胞生長、促進細胞凋亡[14]。以上研究都表明SIAH2與腫瘤細胞的生長、侵襲、增殖密切相關。本研究發現，與未處理組和control siRNA組比較，干擾SIAH2表達后，肺癌細胞系A549和SK-MES-1增殖能力顯著降低，侵襲能力明顯減弱。

SIAH2可通過2條途徑調控腫瘤的形成與生長侵襲，即SIAH2/Ras或SIAH2/HIF-1α通路[15]。在缺氧環境下，SIAH2可調控HIF-1α的表達[16]，降低SIAH2的活性可通過HIF-1α途徑來抑制腫瘤細胞轉移[17]。過表達HIF-1α可通過上調MMP2的表達與增加其活性來促進肺腺癌細胞的侵襲轉移[18]?；谝陨涎芯拷Y果，我們推測SIAH2可能通過調控MMP2的表達來影響肺癌細胞的生物學行為。免疫組織化學結果表明MMP2在NSCLC組織中高表達，與肺癌的低分化、高TNM分期和淋巴結轉移顯著相關，且SIAH2與MMP2表達呈正相關。RT-PCR與Western blot結果發現MMP2在NSCLC細胞中表達高于正常支氣管上皮細胞。我們采用SIAH2 siRNA干擾SIAH2表達后，RT-PCR與Western blot檢測結果發現MMP2表達明顯下降。這些結果都表明SIAH2與MMP2在NSCLC中密切相關，SIAH2可能通過MMP2來發揮生物學作用，具體機制有待于我們進一步研究。

綜上所述，SIAH2在NSCLC惡性進程中發揮重要作用，MMP2可能參與其中，這將為SIAH2調控腫瘤生長侵襲的機制研究提供新思路。

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（本文編輯：趙翠翠）

Expression and significance of SIAH2 and MMP2 in non-small cell lung cancer

YANG Zhiqiang, WEN Yuanyuan, LI Lue.
Department of Respiratory Medicine, Zhoushan Hospital, Zhoushan, 316021

Objective:To study the SIAH2 and MMP2 expression in non-small cell lung cancer (NSCLC), and analyze the relationship between the expression and clinical pathological features and the malignant degree of lung cancer.Methods:Immunohistochemistry S-P method was used to examine the expression of SIAH2 and MMP2 protein in 120 paraff n-embeded specimens with NSCLC, and analyzed the correlation between the expression and clinical pathological factors. The expressions of SIAH2 and MMP2 were detected by RT-PCR and Western blot in lung cancer cell lines. We transfected SIAH2 siRNA into A549 and SK-MES-1 cells using Lipofectamine 2000, and then detected the SIAH2 and MMP2 mRNA and protein expression by RT-PCR and Western blot, thus tested the cell proliferation and cell invasion by MTT and Transwell respectively.Results:Immunohistochemical analysis showed that SIAH2 and MMP2 expression levels were signif cantly higher in NSCLC tissues and signif cantly associated with the higher TNM stage (P=0.019, P=0.020), poor differentiation (P=0.024, P=0.011), and lymph node metastasis (P=0.032, P=0.021). SIAH2 protein expression was positively correlated with MMP2 in NSCLC (r=0.321, P＜0.01). The expression of SIAH2 and MMP2 were higher in lung cancer cells than in normal bronchial epithelial cell (P＜0.05). Compared with the untreated and control siRNA group, the levels of SIAH2 and MMP2 mRNA and protein were decreased in the cells transfected with the SIAH2 siRNA, respectively (P＜0.05). The proliferation rate [P＜0.01 (day 2-4); P＜0.01 (day 2-4)] was slower, and invasion number (17.61±4.34; 20.12±5.43) was decreased in the cells transfected with the SIAH2 siRNA (P＜0.05).Conclusion:Up-regulation of SIAH2 plays an important role in the process of malignant phenotype in human NSCLC, and MMP2 may be involved in this process.

carcinoma, non-small cell lung; seven in absentia homolog; matrix metalloproteinase; proliferation; invasion

R734

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.003

2016-06-22

國家自然科學基金資助項目（81201853）；浙江省自然科學基金資助項目（LY16H160058）；浙江省醫藥衛生科技計劃資助項目（2015121805）。

楊志強（1981-），男，山西臨汾人，主治醫師，博士。

溫媛媛，副主任醫師，Email:wenyuanyuan@sina.cn。