小鼠PD-1胞外段重組蛋白表達及其包涵體復性

江 慧， 康巧珍， 黃夏冰， 張成龍， 劉 鑫

(鄭州大學 生命科學學院 河南 鄭州 450001)

小鼠PD-1胞外段重組蛋白表達及其包涵體復性

江 慧， 康巧珍， 黃夏冰， 張成龍， 劉 鑫

(鄭州大學 生命科學學院 河南 鄭州 450001)

旨在利用原核表達系統制備可溶性的PD-1胞外段(以下簡稱exPD-1)蛋白.以C57BL/6小鼠脾細胞cDNA為模板，擴增小鼠exPD-1基因，成功構建重組質粒pET-28a-exPD-1，并在E.coliBL21(DE3)中誘導表達.結果顯示，小鼠exPD-1重組蛋白大小約為17 kD，以包涵體形式存在.exPD-1包涵體蛋白經8 mol/L尿素變性、Ni-NTA親和層析后，采用尿素梯度透析法對蛋白進行復性，復性效果不佳，添加氧化/還原型谷胱甘肽復性后，復性率達到50%以上，提高了復性效率.小鼠exPD-1蛋白的成功制備，為進一步研究PD-1的免疫學功能奠定了材料基礎.

PD-1; 原核表達載體; 包涵體; 復性

0 引言

PD-1(programmed cell death-1)是一種免疫抑制受體，主要表達于活化的T細胞、B細胞、自然殺傷性T細胞，單核細胞和巨噬細胞.PD-1與其配體PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)結合后，能夠削弱和抑制CD4+T、CD8+T細胞、B細胞、單核細胞的增殖和活化，在腫瘤、 病毒感染、 自身免疫性疾病等方面均發揮重要的免疫調節作用[1-3].PD-1為50～55 kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，胞外區的IgV結構域是其與配體主要結合區域，其胞質尾部的兩個酪氨酸殘基在調控下游信號分子產生免疫負性調節作用中扮演重要角色[4].外源表達的PD-1胞外段(extracellular domain of PD-1，exPD-1)蛋白能夠識別并結合配體，干擾PD-1與配體的結合，阻礙負性信號傳遞.

利用原核表達系統，實現外源基因在基因工程菌中穩定高效表達，可以快速易行地獲得大量目的蛋白，且生產周期短、成本低[5].但是，重組蛋白在大腸桿菌內的高表達易導致形成不溶的、無活性的包涵體.目標基因高拷貝、強效的啟動系統、誘導產物濃度過高都易誘導包涵體的形成，往往需要通過變性溶解，并在適宜條件下復性,使其形成正確折疊，才能得到可溶的、有生物活性的蛋白[6].由于目的蛋白組成及結構的差異，選擇和優化復性方式對獲得有生物活性的蛋白具有重要意義.

本實驗使用基因工程技術獲取小鼠PD-1胞外段基因，將其克隆至原核表達載體pET-28a中，并在宿主菌E.coliBL21(DE3)中表達，得到的包涵體蛋白用含8 mol/L尿素的變性液變性，經Ni-NTA親和層析柱純化后，采取尿素梯度透析復性及添加氧化/還原型谷胱甘肽等小分子物質對蛋白進行復性，成功制備PD-1胞外段蛋白，為進一步研究PD-1的免疫學功能奠定了材料基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

pET-28a質粒為本實驗室保存；E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)感受態細胞購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司.Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、NdeⅠ、XhoⅠ、DNA marker購自Takara公司；氧化型谷胱甘肽(GSSG)、還原型谷胱甘肽(GSH)購自上海生工生物工程公司；ProteinIsoTMNi-NTA Resin、低相對分子質量蛋白marker購自北京全式金有限公司；其余試劑及試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司.PCR引物合成及DNA測序由北京金唯智公司完成.

1.2 小鼠exPD-1的克隆與鑒定

取C57BL/6小鼠脾臟，TRIzol法提取脾細胞總RNA，并反轉錄為cDNA，具體步驟按試劑盒說明書進行.用小鼠exPD-1引物，F：5’-CGGCATATGTCAGGGTGGCTTCTAGA-3’(NdeⅠ)；R：5’-CCCCTCGAGTTATTGAAACCGGCCTTCTG-3’(XhoⅠ)，擴增exPD-1基因.PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃再延伸10 min.取5 μL PCR產物上樣于1%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像分析.PCR產物用DNA片段純化試劑盒純化，用于后續實驗.

1.3 小鼠exPD-1原核表達載體構建

質粒pET-28a和純化后PCR產物分別用限制性內切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產物上樣于1%瓊脂糖凝膠中電泳，使用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收酶切產物，并用T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接，構建重組質粒pET-28a-exPD-1，轉化至E.coliDH5α感受態細胞，挑取單克隆，提取質粒，進行雙酶切鑒定，鑒定正確的送至北京金唯智公司測序.

1.4 小鼠exPD-1蛋白的表達與鑒定

將構建正確的重組質粒pET-28a-exPD-1轉化至宿主菌E.coliBL21(DE3)中，挑取單克隆接種于LB培養基(kan抗性)中，37 ℃振蕩培養過夜.次日按1∶100接種比例接種于LB培養基(kan抗性)中，培養4 h后加入0.2 mmol/L IPTG誘導表達4 h.以E.coliBL21(DE3)和轉化pET-28a的菌株為陰性對照.取菌液，用15% SDS-PAGE電泳分析.

1.5 小鼠exPD-1蛋白表達形式分析、純化及鑒定

9 000 rpm離心5 min收集IPTG誘導后的菌體，用可溶性平衡緩沖液(300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L imidazole，10 mmol/L Tris，pH 8.0)重懸，冰浴條件下使用300 W短脈沖超聲處理(超聲處理10 s，間隔15 s)20 min，9 000 rpm離心20 min，收集上清及沉淀，15% SDS-PAGE分析蛋白表達形式.可溶性平衡緩沖液洗滌沉淀3次后，用變性液(8 mol/L urea，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris，pH 8.0)溶解沉淀，離心收集上清，并用0.45 μm濾膜過濾.使用Ni-NTA親和層析柱對蛋白進行純化，使用不同濃度的咪唑洗脫液(變性緩沖液中分別加入50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L imidazole)梯度洗脫，收集洗脫液，15% SDS-PAGE電泳檢測純化結果，并用Image J圖像分析軟件分析蛋白純度.

1.6 小鼠exPD-1的復性

M：marker； 1：小鼠exPD-1 PCR產物.圖1 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Analysis of PCR products by agarose gel electrophoresis

純化后的蛋白用不同的復性緩沖液進行梯度透析復性.復性緩沖液體系1：配制PBS緩沖液(137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4)，分別加入尿素至終濃度為6 mol/L、4 mol/L、3 mol/L、2 mol/L、1 mol/L、0.5 mol/L；復性緩沖液體系2：在復性緩沖液1的基礎上，在含0.5 mol/L尿素的復性緩沖液中添加1 mmol/L GSH，0.2 mmol/L GSSG.在同一蛋白質量濃度和溫度條件下分別使用體系1和2進行稀釋復性，收集上清進行 SDS-PAGE，并用Image J軟件分析復性效率.

2 結果

2.1 小鼠exPD-1的克隆

以C57BL/6小鼠脾細胞cDNA為模板，PCR擴增小鼠PD-1胞外段基因，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見大小約為450 bp的特異性條帶，與目的基因大小一致(小鼠exPD-1基因為441 bp)(圖1).

2.2 重組質粒pET-28a-exPD-1的鑒定

重組質粒pET-28a-exPD-1經XhoⅠ、NdeⅠ雙酶切鑒定，分別在5 300 bp、450 bp處出現特異性條帶(圖2)，測序結果經Blast比對，與GenBank(X67914.1)同源性達到100%，表明重組質粒pET-28a-exPD-1構建成功.

2.3 小鼠exPD-1蛋白的表達及鑒定

將構建成功的重組質粒pET-28a-exPD-1轉化至E.coliBL21(DE3)中，進行菌落PCR鑒定，正確的陽性克隆菌經IPTG于37 ℃誘導表達4 h，SDS-PAGE結果顯示在17 kD處可見明顯的蛋白誘導條帶(圖3).

1：pET-28a空質粒的XhoⅠ、NdeⅠ雙酶切結果； 2： pET-28a-exPD-1的XhoⅠ、NdeⅠ雙酶切結果； 3：exPD-1 PCR產物；M: marker.圖2 重組質粒pET-28a-exPD-1雙酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pET-28a-exPD-1

M：marker (12～120 kD)；1：宿主菌E.coli BL21(DE3)；2：誘導的E.coli BL21(DE3)/pET-28a； 3：未誘導的E.coli BL21(DE3)/pET-28a-exPD-1；4：誘導的E.coli BL21(DE3)/pET-28a-exPD-1.圖3 小鼠exPD-1蛋白的誘導表達Fig.3 Expression of exPD-1 protein induced by IPTG

2.4 小鼠exPD-1蛋白表達形式分析

收集菌體，超聲破碎后9 000 rpm離心20 min，收集上清及沉淀，SDS-PAGE結果顯示exPD-1蛋白主要以包涵體的形式表達(圖4).

2.5 小鼠exPD-1蛋白的變性與純化

菌體破碎離心后沉淀經可溶性平衡緩沖液洗滌3次后，加入含8 mol/L尿素的變性液對包涵體蛋白變性.使用Ni-NTA親和層析柱對蛋白進行純化，用不同濃度的咪唑洗脫液對蛋白梯度洗脫.SDS-PAGE顯示100～400 mmol/L咪唑洗脫液洗脫率較高(圖5)，圖像經Image J軟件分析，蛋白純度達到80%以上.

M：marker(12～120 kD)； 1：超聲破碎后離心上清；2：超聲破碎后離心沉淀.圖4 小鼠exPD-1蛋白表達形式分析Fig.4 Expression form analysis of exPD-1 protein

1～5：依次為50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L咪唑洗脫液洗脫產物；M：marker (12～120 kD).圖5 小鼠exPD-1蛋白純化Fig.5 Purity of mouse exPD-1 protein

2.6 小鼠exPD-1蛋白的復性

親和層析純化后的蛋白分別用只含尿素的復性緩沖液和添加氧化/還原型谷胱甘肽的復性緩沖液進行梯度透析復性，實驗發現用只含尿素的復性體系對蛋白進行復性時，當尿素濃度降至0.5 mol/L時，會析出大量白色不溶沉淀，可溶性蛋白急劇減少；而添加氧化/還原型谷胱甘肽后，這一現象會得到很高程度的緩解(圖6).SDS-PAGE圖像經Image J軟件分析，結果顯示，只含尿素的復性體系復性率不足10%，使用添加氧化/還原型谷胱甘肽的復性體系后蛋白復性率達到50%以上，提升了約40%的復性效率.

A： 1：復性前蛋白；2～7：依次為含6 mol/L、4 mol/L、3 mol/L、2 mol/L、1 mol/L、0.5 mol/L尿素的復性緩沖液復性蛋白；8：PBS緩沖液復性蛋白.B：1～5:依次為含6 mol/L、4 mol/L、3 mol/L、2 mol/L、1 mol/L尿素的復性緩沖液復性蛋白；6：含0.5 mol/L尿素及GSH/GSSG復性緩沖液復性蛋白；7：含GSH/GSSG的PBS復性蛋白；M：marker (13～90 kD).圖6 小鼠exPD-1蛋白復性Fig.6 Refolding of mouse exPD-1 protein

3 討論

PD-1是一種重要的免疫檢驗點分子，其通過胞外部分與配體結合傳遞負性信號，抑制T細胞活化和細胞因子產生.在正常組織中，PD-1信號在維持體內免疫平衡、防止自身免疫反應中發揮重要作用；但在腫瘤微環境中，這一信號已被證實能夠通過抑制細胞毒性T細胞功能，幫助腫瘤細胞逃避免疫監視[7].利用基因工程技術制備可溶性PD-1胞外段蛋白，或許可以競爭性阻斷PD-1/PD-Ls通路，從而削弱其對T細胞、B細胞功能的抑制作用，增強CTL腫瘤殺傷能力，恢復免疫細胞的特異性的抗病毒功能.已在胰腺癌、黑色素瘤、結腸癌等小鼠腫瘤模型上證實PD-1的阻斷能夠有效增強抗腫瘤T細胞應答，延長小鼠生存期[8-10].此外，研究表明PD-1的阻斷能夠恢復T細胞功能，促進病毒清除[11].

已有研究者利用真核表達系統[12]和pGEX原核表達載體[13]表達PD-1胞外段蛋白.與真核表達系統相比，原核表達載體生產周期短，成本低，蛋白產量高.本實驗成功構建pET-28a-exPD-1重組質粒并轉化至宿主菌E.coliBL21(DE3)中，IPTG誘導表達后，SDS-PAGE檢測到目的蛋白表達，蛋白以包涵體的形式存在.在實驗過程中，為實現其可溶性表達，我們嘗試進行低溫誘導并降低IPTG濃度，希望減緩重組蛋白的表達速率，從而形成正確折疊，但未能阻礙包涵體的形成.進一步我們使用含8 mol/L尿素的變性緩沖液溶解包涵體，采用尿素梯度透析的方式，逐步降低變性劑的濃度來消除變性劑對蛋白的影響，使蛋白重新折疊，以獲得可溶性蛋白.但在實驗的過程中發現，單純降低尿素濃度的復性方式并不能很好地實現exPD-1蛋白的復性，在復性后期，即低濃度的尿素復性緩沖液中，蛋白大量析出，從而嚴重影響復性效果.最終，我們嘗試在含低濃度尿素的復性緩沖液中添加小分子物質氧化型和還原型谷胱甘肽，這種含巰基的化合物能夠提供合適的氧化還原電位，幫助形成正確的二硫鍵[14].實驗結果顯示，此種復性方式蛋白復性率達到50%以上，與單純的尿素梯度透析法相比，復性率明顯提升.

重組質粒pET-28a-exPD-1的成功構建及小鼠exPD-1蛋白的誘導表達和純化，為進一步研究PD-1的免疫學功能奠定了實驗基礎，但蛋白活性驗證及復性方法的進一步優化，仍需要更多實驗研究.

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(責任編輯：王浩毅)

Expression and Refolding of Mouse PD-1 Extracellular Protein inEscherichiacoli

JIANG Hui, KANG Qiaozhen, HUANG Xiabing, ZHANG Chenglong, LIU Xin

(SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

To obtain soluble mouse PD-1 extracellular (exPD-1) protein by using prokaryotic expression system, mouse exPD-1 gene was amplified from C57BL/6 mice spleen cells cDNA by PCR.The recombinant plasmid pET-28a-exPD-1 was constructed and expressed inE.coliBL21(DE3)after IPTG induction. The SDS-PAGE showed that exPD-1 recombined protein was about 17 kD and in the form of inclusion body. After solubilized in 8 mol/L urea and purified by Ni-NTA affinity column, the protein was refolded. A 40% of the renaturation rate was improved by adding GSH/GSSG compared with urea gradient dialysis, in which the former rate of refolding was more than 50%. The mouse PD-1 extracellular protein was successfully prepared, which lay the foundation for further study of the function of PD-1 in immunotherapy.

PD-1; prokaryotic expression vector; inclusion body; renaturation

2016-08-17

重大新藥創制科技重大專項(2012ZX09103301-022);國家自然科學基金項目(U1204817，81373119).

江慧(1991—)，女，河南平頂山人，碩士研究生，主要從事腫瘤免疫研究，E-mail:huijiang1991@126.com；通訊作者：劉鑫(1981—)，女，甘肅白銀人，講師，主要從事免疫性疾病的發病機制及治療研究，E-mail:liux@zzu.edu.cn.

Q786

A

1671-6841(2017)02-0111-05

10.13705/j.issn.1671-6841.2016204