蛋白質印跡法中免染技術和總蛋白定量方法的研究進展

韓欣霖，楊佳儒，寶福凱 ，柳愛華

1.昆明醫科大學 a.云南省高校熱帶傳染病重點實驗室；b.熱帶醫學研究所；c.病原生物學與免疫學系；d.生物化學與分子生物學系；云南 昆明 650500；2.云南省公共衛生與疾病防控協同創新中心，云南 昆明 650500；3.云南省熱帶病示范型國際科技合作基地，云南 昆明 650500

蛋白質印跡法中免染技術和總蛋白定量方法的研究進展

韓欣霖1a，1c，楊佳儒1a，1d，寶福凱1a，2，1b，1c，3，柳愛華1a，2，1b，1d，3

1.昆明醫科大學 a.云南省高校熱帶傳染病重點實驗室；b.熱帶醫學研究所；c.病原生物學與免疫學系；d.生物化學與分子生物學系；云南 昆明 650500；2.云南省公共衛生與疾病防控協同創新中心，云南 昆明 650500；3.云南省熱帶病示范型國際科技合作基地，云南 昆明 650500

當含有蛋白質的SDS-PAGE膠浸泡在三氯乙酸或氯仿中時，經三氯化合物的作用，使得蛋白質中的色氨酸經紫外光照射會發出可見光，因而可在SDS-PAGE凝膠上實現對蛋白質條帶的定位與定性。免染技術即是基于此原理而發明的。基于免染技術，我們可以檢測到待測樣品中的總蛋白條帶的光密度，進而利用目的蛋白條帶光密度與總蛋白條帶光密度的比值對目的蛋白進行定量。本文就蛋白質印跡法技術中的免染技術和總蛋白定量方法的原理和優勢進行簡要綜述。

免染技術；β肌動蛋白（β-actin）；β微管蛋白（β-tublin）；甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）；總蛋白定量

自1979年首次應用以來，蛋白質印跡法（Western blot）已成為測定復雜生物樣品中蛋白質相對表達的關鍵技術。使用Western印跡的生物化學分析是確定復雜生物樣品中相對蛋白表達量的重要工具，Western印跡通常與大規模篩選技術如蛋白質組學結合使用，以確認各種疾病模型中不同目的蛋白的表達[1]。雖然成像和試劑技術在不斷提高靈敏度、動態檢測范圍和多重目標檢測的適用性方面已經取得了顯著進步，但是在最基本的技術上幾乎沒有變化。在過去，蛋白質印跡僅用于檢測復雜混合物中的特定靶蛋白，但是現在許多學術期刊要求作者在樣品之間蛋白質表達的倍數變化方面對Western印跡數據進行定量解釋[2]。近年來開發了新方法，涵蓋了完整的Western印跡工作流程，重點是樣品制備和數據分析的定量免疫印跡方法。

1 內參蛋白定量和總蛋白定量的比較

蛋白質印跡用于特異性地測量復雜生物樣品中目蛋白的相對表達量。定量測量可能由于過程不一致而產生誤差，例如轉膜時蛋白質轉移不均勻，包括樣品制備和加樣錯誤，以及轉膜時蛋白質轉移不均勻。這些非樣本相關誤差需要通過歸一化的方法來彌補。目前通常采用2種數據標準化方法：內參蛋白（house keeping protein，HKP）標準化和總蛋白標準化（total protein nor?malization，TPN）[3]。

1.1 β-actin等內參蛋白在Western印跡實驗中不是一個可靠的上樣對照[4]

傳統上，由于缺乏累積發光線性和有限的定量再現性，使用ECL（增強化學發光）的Western印跡被稱為半定量技術[5]。隨著更敏感的熒光標記的發展，其表現出比常規ECL檢測更大的可量化的線性范圍、靈敏度和穩定性，蛋白質表達的分析可以被合理地稱為“定量”[6]。因此，必須以更高的精確度確保樣品上樣的均勻性，以避免在使用這些更高分辨率的工具時錯誤的數據采集[7]。為了準確測量樣品中的蛋白質水平，“上樣對照（loading control）”蛋白質通常用作內參。上樣對照通常來自普遍表達的看家基因，并且由于它們在不同范圍的樣品中特定的一致的表達水平而被廣泛使用。β肌動蛋白（β-actin）和甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）是生物醫學研究中最常用的2種內參對照，然而越來越多的研究表明它們在動物和實驗模型中的表達存在差異[4,8-11]。

已有研究表明，在運動神經元病癥脊髓性肌萎縮（SMA）的小鼠模型的病理學影響的組織中，β-actin和β-tublin差異表達[12-13]。該研究使用建立的嚴重SMA的小鼠模型，從中得到脊髓組織，來量化β-actin和β-tublin的蛋白表達水平。當使用Western印跡定量（QWB）來比較SMA小鼠受影響的脊髓與對照組織時，發現了β-actin和βtublin表達水平的改變。與對照組織相比，SMA組織中的β-actin和β-tublin表達顯著下調。該研究從一系列疾病模型的受累組織中可以檢測到對照蛋白表達的顯著改變，鑒定了健康（野生型）組織中內參蛋白表達的差異性，并且確定了在同一個體內不同組織中內參蛋白的表達同樣存在差異。該實驗使用C57B1/6（野生型）小鼠的研究表明，當比較同一小鼠的不同組織時，β-ac?tin的表達顯著不同。在心臟和脾臟組織之間觀察到β-actin蛋白表達的顯著差異，當比較這些組織時，將數據歸一化用于不同組織比較，β-actin蛋白表達可以因此導致數據偏斜高達22倍。然而，該實驗同樣證明了在某些組織如骨和脂肪之間的β-actin表達存在同源性，也就是說，在這些組織中，可以將β-actin作為內參蛋白使用，但也僅在這些特定的組織中能夠使用。例如，魚類中實時熒光定量PCR（qRT-PCR）的研究與該研究的發現相一致，該研究證明β-actin在心臟、肌肉和腦的某些組織中不是理想的加樣對照，但其在腎臟和脾臟的表達結果一致，可作為內參蛋白[14]。此外，更進一步的研究表明在不對稱組織中，βactin等常作為加樣對照的內參蛋白的表達量也是不均一的。例如，在比較坐骨神經近端到遠端部分時，相比之下，神經絲（NF-L）（神經元細胞骨架的主要組分）的表達明顯更高[15]，接近8倍，在坐骨神經的遠端部分達到4倍SEM。因此，這些結果強調，即使對單個動物的相同組織用于比較分析時，解剖的準確性和一致性也是至關重要的。此外，有研究證明內參蛋白在不同組織或在暴露于感染因子后表達量也不同[14]。因此，根據內參蛋白定量產生的數據可能導致錯誤的結果。

1.2 總蛋白定量是一種測定蛋白上樣量的精確方法

在選擇QWB內參過程中需要考慮幾個重要的變量因素，包括敏感度的線性范圍、不同組織或同一組織中蛋白質的表達量差異等。為了確定QWB實驗中總蛋白分析法是否是一種精確、可靠的檢測蛋白上樣量方法，有研究者用牛血清白蛋白（BSA）經梯度稀釋法建立了蛋白標準品，并以此評估檢測靈敏度[1]。BSA的相對分子質量為66 500，在該處可以檢測到線性熒光條帶，并且在很大的濃度范圍內都存在良好的線性關系，與其0.998的變異系數一致。重要的是，BSA標準品溶液有效證明了信號條帶的強弱很好地代表了蛋白質上樣量的變化。這不僅證明了使用該方法檢測蛋白質的良好線性關系，也證明此方法中不存在通常出現于ECL蛋白檢測法中的色彩飽和度問題。最終，當應用LICOR Odyssey定量掃描系統檢測真正的生物樣品時，在很大的蛋白濃度范圍內檢測蛋白質上樣量時總蛋白定量法（使用考馬斯亮藍）都有著優于內參蛋白β-actin和β-tubulin的良好線性（1～40 μg）。BCA法和總蛋白定量法的變異系數分別為0.979和0.996，表明這2種方法都具有良好的線性。此外，在蛋白質溶液上樣量的范圍大至1～40 mg時，總蛋白分析得出的數據仍與BCA法所得出的數據具有非常直接的相關性，進一步說明總蛋白定量是一個非常可靠的蛋白質上樣量對照。因此，我們認為總蛋白定量提供了一種可避免單一蛋白對照所帶來的各種問題的測定蛋白上樣量的方法。總蛋白定量的優點如下：①在來自不同模型的不同組織中，它是穩定不變的；②在不同類型的組織中，它是穩定的；③在同一組織的不同部位中，它是穩定的。總蛋白定量是QWB中一種簡單的技術，用來準確地確定在凝膠內是否已達到等同的蛋白質載量[16]。通過總蛋白定量獲得的數據避免了用內參蛋白產生的誤差。這并不意味著看家基因不能用做上樣對照，在明確掌握解剖結構和內參蛋白表達的情況下，可以引用內參蛋白，但是相比之下，總蛋白定量應用的范圍和精確度更廣更好，因此，建議使用總蛋白定量以節省時間、資源，增加靈敏度和準確度，并且不必考慮將內參蛋白作為上樣對照時的限制問題。因此，總蛋白定量應被作為現代熒光定量Western印跡中數據標準化的替代參考標準[17]。

2 免染技術基本概念

2002年，《Analytical Biochemistry》上的一篇文章中第一次提到免染技術（stain free）。免染技術主要包括2個部分，即免染膠和Chemi Doc MP全能成像系統，分析結果時需要Image Lab軟件。免染膠與普通的預制膠不同，免染膠包含特有的免染技術，因此不能用預制膠代替。樣品制備及電泳步驟與普通電泳一樣。電泳后，取出凝膠，置于Chemi Doc MP全能成像系統中。通過電泳分離的蛋白經特定波長的紫外線（UV）照射而激活，產生熒光，從而被CCD照相機捕獲，1～2 min即能顯示總蛋白條帶，Image Lab軟件根據蛋白marker自動估算各條帶的相對分子質量和數量。

2.1 免染技術原理

免染技術利用可以在預制膠內使用的化學物質，在凝膠制劑中摻入三鹵代化合物，當暴露UV輻射時，其催化三鹵代化合物和色氨酸殘基之間的共價反應。所得的“活化的”蛋白質在UV激發下發熒光，可以通過合適的成像系統在凝膠內或在轉移到印跡膜之后檢測[18]。

2.2 免染技術的優點

免染技術為Western印跡工作流程中的數據標準化提供了一種新型的質控工具[3]。免染法能夠檢測和校正實驗過程中的誤差。免染技術顯示出在整個Western印跡過程中的更多優勢。通過免染法可在Western印跡過程中提前檢測到相關嚴重問題，并且在抗體孵育之前停止。能夠及時檢測到抗體孵育之前的凝膠性能和蛋白質轉膜情況，節省大量時間，并且避免之后的資源浪費。免染技術體現了現有的基于染色法的總蛋白定量方法的優勢，常見的TPN染色包括麗春紅染色液、Sypro Ruby蛋白質印跡免染和考馬斯亮藍R-350。De Medina等報道[19]麗春紅染液的線性范圍高達140 μg，但是其染色時間長，信噪比低，重復性差。Aldridge等檢測了[17]Sypro Ruby印跡染色對腦勻漿的稀釋樣品（每個泳道22～41 μg蛋白質）的性能，發現染色在其特定工作濃度范圍內呈線性。然而，Sypro Ruby染色需要不斷的時間消耗，并且更適用于各泳道大于50 μg的蛋白上樣量。Welinder和Ekblad報道了[16]在免疫檢測GAPDH后用考馬斯亮藍R-350作為總蛋白染色方法，它們通過SDS-PAGE從細胞裂解物中分離2～25 μg總蛋白，證明了該染色法在該范圍內的線性。然而，它們的總蛋白染色方法僅限于PVDF膜，因為考馬斯亮藍染色導致硝酸纖維素膜上非常高的背景。

免染技術的另一個顯著優點是快速顯現凝膠電泳分離蛋白質和轉膜的能力。此外，免染技術兼容硝酸纖維素膜和PVDF膜。免染技術以成像系統標準化和無偏差的方式進行數據采集處理。數據標準化的傳統方法是基于各種HPK的表達水平一致的認識之上，但目前利用免染技術進行總蛋白定量被認為是檢測細胞裂解物總蛋白質含量的良好代表。越來越清楚的是，HPK方法在其一般適用性方面受到限制。任何蛋白質作為標準化對照的第一個先決條件是證明在所研究的樣品中穩定表達[20]。因此，合適的內參蛋白選擇需要消耗一定的時間去驗證[21]。此外，基于HKP的標準化需要對抗體稀釋、孵育時間和成像設置進行優化。與免染技術相比，這是一個非常漫長的過程，免染技術總蛋白定量的方法提供了精確的蛋白質上樣載量，而不需要長時間的優化完善。此外，HKP定量方法基于每個電泳道的單個蛋白質的比較，而免染技術的總蛋白質定量方法利用了給定蛋白質樣品中的所有信息。

3 蛋白樣品制備是實驗可信度的先決條件

蛋白樣品的制備可直接影響蛋白質印跡上條帶的光密度，以下列出幾項蛋白樣品制備時可能遇到的問題：①組織或細胞樣本的處理不當會導致蛋白質樣品降解和/或表達；②裂解緩沖液中清洗劑、鹽和蛋白酶抑制劑不足；③BCA試劑盒測定蛋白濃度不準確。

由于蛋白裂解物與污染物如細胞或組織碎片、脂肪、疏水蛋白聚集體、核酸和蛋白酶的復雜性，可對Western印跡結果產生直接和負面的影響，因此使用細胞裂解緩沖液和勻漿技術消除其影響非常重要[22]。通常，含有非離子洗滌劑如NP-40和Triton X-100的緩沖液比離子洗滌劑如SDS和脫氧膽酸鈉產生的刺激更小。通常加入濃度為100～150 mmol/L的鹽（如NaCl或KCl）以防止蛋白質凝集。RIPA緩沖液［1%NP-40或Triton X-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，150 mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl（pH7.8），1mmol/L EDTA］和蛋白酶抑制劑混合物用機械或手動儀器產生勻漿，這可以為Western印跡結果的測定提供可靠的數據。組織勻漿技術的正確選擇是Western印跡測定成功的先決條件，并且所采用的方法完全取決于樣品類型。其中一個方法是，對于細胞裂解，將沉淀的細胞（在細胞懸浮液的情況下）加入冰冷（4℃）的RIPA緩沖液或鋪板的細胞中，將細胞洗滌后，將冰冷的RIPA緩沖液直接加入板中，刮下并吸取細胞。來自細胞或組織裂解物的勻漿的總蛋白濃度應使用BCA法測定。理想地，勻漿將被稀釋至至少2 mg/mL的濃度，這將允許每個泳道10～80 μg 1 mm厚的微型聚丙烯酰胺SDS凝膠上樣。

4 結語

蛋白質印跡分析是最廣泛使用的對目的蛋白質進行半定量測定的方法之一。Western印跡實驗耗時長，包含許多操作步驟（如蛋白質濃度測定、SDS-PAGE、轉膜），會增加很多帶入誤差的幾率[3]。為了準確比較蛋白質印跡信號，必須補償信號強度（與樣品本身無關），這種方法被稱為歸一化，并且在本領域中被廣泛運用。使用蛋白質印跡的蛋白質的半定量通常涉及針對看家蛋白（如β-actin）的標準化。為了校正可能存在的蛋白質上樣的不準確性，一般都會增加具有相對恒定表達的“看家蛋白”作為內參載量對照。這些蛋白質在許多不同的樣品中含量豐富，并且它們的表達水平通常被認為對各種生理條件和處理的影響不敏感。2種最常用的內參對照是βactin和GAPDH。然而，幾個最近的報告表明，以看家蛋白作為內參對照須仔細評估。選擇HKP時應當謹慎，因為不是所有的HKP表達水平在實驗條件或不同樣品類型的變化下保持恒定，常用于數據標準化的HKP包括β-actin[23]、β-tublin[24]和GAPDH[25]。TPN利用加載在給定泳道中的整個樣品的信號強度作為靶蛋白信號的加載對照。由于在各種實驗條件下存在HKP表達變化的可能，通常建議使用多個HKP標準化Western印跡結果，從而增加實驗的時間和復雜性。相比之下，TPN的使用具有使單個蛋白質的表達變化的影響最小化的優點。最近，麗春紅染色和考馬斯亮藍染色已被證明是作為上樣對照的管家基因的合適替代物。免染技術的總蛋白染色具有無須染色或脫色步驟的優點。使用免染技術作為β-ac?tin或蛋白質染色液的替代品的評價顯示，基于免染法總蛋白定量的方法優于β-actin等內參蛋白，并且優于作為蛋白質印跡上樣對照的麗春紅染色等染色方法。

通過良好的樣品制備技術、檢測方法、軟件和分析的共同協作，能夠實現蛋白質印跡的準確密度計量分析，這些分析最終能夠產生十分滿意的結果。為了獲得最大程度的重復和完整性，強烈推薦運用基于免染技術的總蛋白定量方法，因為這種方法為免疫印跡實驗過程中數據的精確標準處理提供了新穎獨特的質控工具。

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Progress of Stain-Free Technology and Total Protein Analy?sis in Western Blotting

HAN Xin-Lin1a,1c,YANG Jia-Ru1a,1d,BAO Fu-Kai1a,2,1b,1c,3*,LIU Ai-Hua1a,2,1b,1d,3*
1.a.Yunnan Province Key Laboratory for Tropical Infectious Diseases in Universities;b.Institute for Tropical Medicine;c.Department of Microbiology and Immunology;d.Department of Biochemistry and Molecular Biology;Kunming Medical University,Kunming650500;2.Yunnan Province Integrative Innovation Center for Public Health,Diseases Prevention and Control,Kunming 650500;3.Yunnan Demonstration Base of International Science and Technology Cooperation for Tropical Diseases,Kunming 650500;China

Based on the principle that after UV stimulation,the tryptophan will emit visible light when a SDSPAGE gel containing proteins be soaked in the trichloroacetic acid or chloroform,the stain-free technology was in?vented.By means of stain-free technology,we can examine the optical density（OD）value of total protein in sam?ples and then,we can quantify the target protein through utilizing the OD value ratios between target protein and total proteins.Here,we summarized the principle and advantages of the stain-free technology and the total protein analysis method.

stain-free technology;β-actin;β-tublin;GAPDH;total protein analysis

Q51

A

1009-0002（2017）05-0709-06

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,BAO Fu-Kai,E-mail:baofukai@kmmu.edu.cn;LIU Ai-Hua,E-mail:liuaihua@kmmu.edu.cn

2017-04-01

國家自然科學基金（81371835，31560051，81560596）

韓欣霖（1992- ），女，碩士研究生；楊佳儒（1987- ），男，碩士研究生；二者為共同第一作者

寶福凱，（E-mail）baofukai@kmmu.edu.cn；柳愛華，（E-mail）liuaihua@kmmu.edu.cn