不同濃度依達拉奉對低氧環境下c-kit+心臟干細胞的影響

文德重，周敏，薛松，黃日太

(上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，上海200127)

不同濃度依達拉奉對低氧環境下c-kit+心臟干細胞的影響

文德重，周敏，薛松，黃日太

(上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，上海200127)

目的 觀察不同濃度的依達拉奉對于低氧環境下c-kit+心臟干細胞 (CSCs)的影響。方法 體外灌注酶解成年小鼠心臟，磁珠分選c-kit+CSCs，流式細胞儀和免疫熒光染色分別檢測分選后干細胞純度和表型。將c-kit+CSCs培養基中加入不同濃度依達拉奉(0、100、300、500、700、1 000 μmol/L)，在1%氧條件下分別通過免疫熒光顯微鏡下DFCH-DA檢測細胞活性氧(ROS)生產量、流式細胞儀檢測凋亡率、Transwell檢測細胞遷移能力、RT-PCR檢測成纖維細胞生長因子(bFGF)mRNA表達。結果 依達拉奉濃度為1 000 μmol/L時所產生的ROS量最少,與其他濃度比較有統計學差異(P均<0.05)。依達拉奉濃度為1 000 μmol/L時細胞凋亡率最低,與0、100 μmol/L濃度比較有統計學差異(P均<0.05)。依達拉奉濃度為700 μmol/L時c-kit+CSCs遷移數最大,與0 μmol/L比較有統計學差異(P<0.05)。依達拉奉濃度為700 μmol/L時，c-kit+CSCs bFGF mRNA表達最高(P均<0.05)。結論 依達拉奉通過影響細胞的凋亡率、遷移率、ROS生成和bFGF mRNA的表達對c-kit+CSCs發揮保護作用，且在一定濃度范圍內存在劑量依賴性。

心臟干細胞；依達拉奉；活性氧；細胞凋亡；細胞遷移；成纖維細胞生長因子

心臟干細胞(CSCs)移植為心肌梗死后心功能損傷的治療帶來了希望，目前已成為再生醫學的研究熱點。但是有研究發現干細胞移植后的存活率不超過10%，不足以修復壞死的心肌組織[1, 2]。主要是因為移植的干細胞處于缺血缺氧環境下，細胞氧化應激過度，導致細胞死亡。依達拉奉是一種新型的氧自由基清除劑，已廣泛應用于急性腦缺氧性疾病。研究發現依達拉奉能夠清除心肌缺血再灌注后產生的自由基，抑制細胞凋亡，對心肌具有一定的保護作用[3, 4]。但是，依達拉奉對于低氧下c-kit+CSCs的影響國內外文獻報道較少。2016年4～11月，本文就不同濃度的依達拉奉對低氧條件下c-kit+CSCs活性氧(ROS)生成、凋亡率、遷移能力和成纖維細胞生長因子(bFGF)表達的影響進行了研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF 級C57雄性小鼠， 6～8周齡，體質量18～20 g，購于上海杰思捷實驗動物有限公司。胎牛血清(FBS)、Ⅱ型膠原酶、DMEM-F12培養基、N2、B27、胰蛋白酶、白血病抑制因子(LIF)、表皮生長因子(EGF)、bFGF、胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉(ITS)、小鼠c-kit磁珠、CD45 磁珠、抗c-kit免疫熒光抗體、抗鼠c-kit PE流式抗體、PE Annexin V凋亡試劑盒、0.5%結晶紫、Transwell小室、DFCH-DA、依達拉奉、RNA 抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒。

1.2 CSCs分離、分選及純度檢測 成年C57小鼠腹腔注射肝素100 IU，10 min麻醉后無菌條件打開胸腔，小心分離心臟，盡快將心臟懸掛于無菌心臟灌注裝置，6-0絲線固定。用氧飽和的含0.1% Ⅱ型膠原酶的心肌消化液37 ℃灌注10 min，流量控制為4 mL/min。當心臟變白變軟停止灌注，并將心臟轉移至含預冷2%FBS的DMEM-F12培養基中，小心吹打，將心肌組織解離成單個細胞。40 μm濾網過濾，300 g離心1 min去除心肌細胞，將上清轉移至另一離心管，再330 g離心7 min去除上清。細胞重懸于100 μL的PBS緩沖液中，加入5μL CD117 PE Labeling Reagent，常溫避光孵育15 min。加入7 μL PE Selection Cocktail，混勻后常溫避光孵育15 min。加入5 μL磁珠，吹打混勻，避光孵育10 min。加入2 mL 的PBS緩沖液混勻，并將流式管放于磁鐵中靜置5 min后，緩慢棄去上清液，重復4～5次。將分選的細胞培養于DMEM-F12，內含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10 ng/mL LIF、10 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、1% ITS、1% B27、0.5% N2。分選后含有CD117 PE標記的CSCs重懸于100 μL的PBS緩沖液中，通過流式細胞術檢測c-kit+CSCs純度達到89.3%；免疫熒光染色顯示細胞已經貼壁，大部分細胞為c-kit+CSCs。

1.3 不同濃度依達拉奉作用后c-kit+CSCs ROS生成檢測 將培養的CSCs接種于24孔板中，每孔0.5×105個細胞，貼壁24 h。用含20 μmol/L DCFH-DA的培養基37 ℃避光孵育30 min后棄去，更換為含不同濃度依達拉奉(0、100、300、500、700、1 000 μmol/L)的細胞完全培養基，在37 ℃、1%O2、94%N2、5%CO2的培養箱中避光培養8 h。取出細胞，PBS 洗滌3次，免疫熒光顯微鏡488 nm波長下曝光1 s拍照。DFCH-DA在細胞中可被酯酶去乙?；兂蓻]有熒光的DFCH，DFCH可以與細胞內產生的ROS結合，生成有綠色熒光的DFC。綠色熒光細胞數與ROS的生成呈正相關，以綠色熒光細胞數表示ROS生成數量。

1.4 不同濃度依達拉奉作用后c-kit+CSCs凋亡率檢測 將培養的CSCs接種于24孔板中，每孔1×105個細胞，貼壁24 h后，將培養基更換為含不同濃度依達拉奉(0、100、300、500、700、1 000 μmol/L)的無血清DMEM-F12培養基中，在37 ℃、1%O2、94%N2、5%CO2的培養箱中避光培養48 h。收集細胞，預冷PBS洗滌2次，重懸于50 μL的結合液中，并加入2.5 μL的PE Annexin V和2.5 μL的7-AAD染色液。另設3管對照，分別為空白細胞管、僅加2.5 μL PE Annexin V 細胞管和僅加2.5 μL 7-AAD細胞管。混勻，室溫避光孵育15 min，加入150 μL的結合液，混勻，上機檢測。

1.5 不同濃度依達拉奉作用后c-kit+CSCs遷移能力檢測 培養的CSCs用無血清的DMEM-F12培養基饑餓12 h。胰酶消化，加入10%FBS的DMEM-F12培養基中和，1 000 r/min離心5 min。重懸細胞于無血清的DMEM-F12培養基中，調整細胞濃度為2.5×105個/mL。吸取細胞200 μL，加入到8 μm的Transwell 小室上層。下層加入500 μL含不同濃度依達拉奉(0、100、300、500、700、1 000 μmol/L)10% FBS 的DMEM-F12培養基中，在37 ℃、1%O2、94%N2、5%CO2的培養箱中避光培養8 h。4%的多聚甲醛固定30 min，0.5%結晶紫染色30 min。用棉簽將Transwell上層細胞擦去，顯微鏡下觀察拍照。

1.6 不同濃度依達拉奉作用后c-kit+CSCs bFGF檢測 將培養的CSCs接種于24孔板中，每孔1×105個細胞，貼壁24 h。更換為含不同濃度的依達拉奉(0、100、300、500、700、1 000 μmol/L)的無血清DMEM-F12培養基中，在37 ℃、1%O2、94%N2、5%CO2的培養箱中避光培養24 h。利用小劑量RNA 抽提試劑盒提取出總RNA，260/280 nm 吸光度用來判斷RNA 的質量?？俁NA(0.5 μg)用逆轉錄試劑盒轉錄成cDNA。之后使用bFGF引物進行PCR 擴增。樣品電泳完畢后，將凝膠放入ChemiDoc MP 凝膠成像系統( Bio-Rad 公司，美國) 觀察拍照，然后使用ImageLab軟件進行數據處理。

2 結果

2.1 不同濃度依達拉奉對c-kit+CSCs ROS生成的影響 依達拉奉可以減少低氧下c-kit+CSCs ROS的生成。依達拉奉濃度為0、100、300、500、700、1 000 μmol/L時，綠色熒光細胞數分別為(81±8)、(56±6)、(45±4)、(27±2)、(22±2)、(13±1)個。依達拉奉濃度為1 000 μmol/L時所產生的ROS量與其他濃度比較有統計學差異(P均<0.05)。依達拉奉濃度700 μmol/L與500 μmol/L比較，ROS生產量無統計學差異(P>0.05)。

2.2 不同濃度依達拉奉對c-kit+CSCs凋亡率的影響 依達拉奉可以降低細胞凋亡率。依達拉奉濃度為0、100、300、500、700、1 000 μmol/L時，c-kit+CSCs凋亡率分別為(44.6±4.70)%、(36.93±7.81)%、(31.43±5.01)%、(28.57±3.25)%、(28.8±1.75)%、(25.13±2.40)%。依達拉奉濃度為1 000 μmol/L時細胞凋亡率與0、100 μmol/L濃度比較有統計學差異(P均<0.05)。300～1 000 μmol /L濃度之間細胞凋亡率無統計學差異(P均>0.05)。

2.3 不同濃度依達拉奉對c-kit+CSCs遷移能力的影響 在低氧環境中，依達拉奉處理可以明顯促進CSCs的遷移能力。依達拉奉濃度為0、100、300、500、700、1 000 μmol/L時， c-kit+CSCs遷移數分別為(93.3±6.6)、(97.3±4.5)、(120.3±8.3)、(128.0±6.2)、(139.3±2.9)、(138.0±7.9)個。依達拉奉濃度為700 μmol/L時c-kit+CSCs遷移數與0 μmol/L比較有統計學差異(P<0.05)。700 μmol/L與1 000 μmol/L、100 μmol/L與0 μmol/L比較，c-kit+CSCs遷移數均無統計學差異(P均>0.05)。

2.4 不同濃度依達拉奉對c-kit+CSCs bFGF表達的影響 依達拉奉可顯著促進c-kit+CSCs bFGF的表達。依達拉奉濃度為0、100、300、500、700、1 000 μmol/L時，c-kit+CSCs bFGF mRNA 表達分別為0.59±0.05、1.21±0.03、1.32±0.09、1.46±0.17、1.74±0.09、0.87±0.05。依達拉奉濃度為700 μmol/L時，c-kit+CSCs bFGF mRNA表達最高(P均<0.05)。100～500 μmol /L濃度之間c-kit+CSCs bFGF mRNA表達無統計學差異(P均>0.05)。

3 討論

CSCs是一類存在于自體心肌組織中的干細胞，可以向心肌、血管平滑肌、內皮細胞方向分化。研究發現，c-kit+CSCs移植后可通過細胞分化、新生血管形成、旁分泌等途徑改善心肌梗死后心功能，成為干細胞移植的研究熱點[5, 6]。但是移植到體內的干細胞長期存活率較低，并不能持續改善心功能。

依達拉奉具有較好的細胞保護作用，已經廣泛應用于心血管疾病基礎和臨床研究[7, 8]。但是研究發現，在不同情況下依達拉奉表現出不同的細胞保護效應。張藹玲等[9]研究結果顯示，依達拉奉預處理H9c2心肌細胞，可顯著減少氯化鈷誘導的ROS 生成，還能通過維持線粒體膜電位的穩定性起到保護作用。Sukmawan等[10]研究結果顯示，依達拉奉可通過提高細胞一氧化氮水平和降低ROS的產生，保護犬缺血再灌注冠脈血管內皮細胞，減輕冠脈內皮細胞的損傷。Hassan 等[11]研究顯示，在異丙腎上腺素誘導的心肌梗死大鼠中，依達拉奉預處理可通過減少氧化應激、維持細胞膜的完整性、抗凋亡、抗炎癥等途徑，調節對心肌細胞的保護功能。劉品剛等[12]研究認為，依達拉奉是通過降低心肌半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3及炎癥因子TNF-α、IL-6 的表達，抑制炎癥誘導的凋亡，發揮心肌保護作用。Tsujita 等[13]在對50例急性心肌梗死患者注射30 mg依達拉奉后發現可顯著改善灌注后心肌梗死面積，有效減少灌注心律失常的發生。蔡志福等[14]研究結果顯示，在心臟直視手術中，依達拉奉可以減少血清中的丙二醛含量，降低心肌酶漏出量，提高心肌細胞SOD的活性，減輕心肌細胞損傷。本研究結果顯示，不同濃度依達拉奉處理都可以降低低氧環境下c-kit+CSCs ROS的含量。且隨著依達拉奉濃度的增加，ROS的含量逐漸減少；當濃度為1 000 μmol/L時，ROS的含量達到最小值。在晚期凋亡率方面，當依達拉奉濃度在300～1 000 μmol/L時，雖然隨著濃度增加細胞凋亡率逐漸下降，但這種下降的幅度越來越小。依達拉奉處理可以促進低氧環境下c-kit+CSCs的遷移和bFGF的生成。濃度為100～700 μmol/L時，隨著濃度的增加，遷移細胞數逐漸增加，在700 μmol/L濃度時達到最高，但當濃度達到1 000 μmol/L時，遷移率不再增加。依達拉奉濃度在100～700 μmol/L之間，c-kit+CSCs bFGF mRNA表達量逐漸升高。這一結果與其他研究結果相似[15]。

綜上所述，依達拉奉對低氧環境下c-kit+CSCs損傷具有較好的保護作用，且在一定濃度范圍內對c-kit+CSCs的影響具有劑量依賴性。但是，當c-kit+CSCs移植到心梗環境中依達拉奉的這種保護作用是否仍然存在還需要進一步驗證。

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Effects of different concentrations of edaravone on c-kit+cardiac stem cells under hypoxic conditions

WENDezhong,ZHOUMin,XUESong,HUANGRitai

(RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200127,China)

Objective To observe the effects of different concentrations of edaravone on c-kit+cardiac stem cells (CSCs) under hypoxic conditions. Methods The freshly isolated hearts were perfused with collagenase buffer, and the hearts were dissected into single cells, c-kit+cells were purified from the cells by immunomagnetic beads. Flow cytometric analysis was used to measure the purity of c-kit+cells, immunofluorescence was used to analyze the phenotype. For further study, c-kit+CSCs were treated with different concentrations of edaravone (0, 100, 300, 500, 700, 1 000 μmol/L), and then were divided into six groups. The reactive oxygen species (ROS) production was measured by DFCH-DA, apoptosis rate was analyzed by flow cytometer, cell migration was measured by 8-mm pore-size Transwell migration chamber, and the expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) mRNA was determined by RT-PCR. Results The ROS production in the 1 000 μmol/L edavarone group was significantly decreased as compared with that of the other groups (allP<0.05). The apoptosis rate in the 1 000 μmol/L edavarone group was the lowest, and significant difference was found as compared with that in the 0 and 100 μmol/L edavarone groups (allP<0.05). The migration of c-kit+CSCs was the highest when edavarone concentration was 700 μmol/L, and significant difference was found as compared with that of the 0 μmol/L. When the concentration of edavarone was 700 μmol/L, the expression of bFGF mRNA in c-kit+CSCs was the highest (allP<0.05).Conclusion Edaravone has the protective effect on c-kit+CSCs by influencing the apoptosis rate, migration rate, ROS production and bFGF mRNA expression with a dose-dependent manner to some extent.

cardiac stem cells; edaravone; reactive oxygen species; apoptosis; cell migration; fibroblast growth factors

上海市自然科學基金資助項目(134119a5602)。

文德重(1990-)，男，在讀碩士，主要研究方向為房顫的發生機制。E-mail：wendezhongwencong@163.com

黃日太(1970-)，男，醫學博士，教授，主要研究方向為房顫的發生機制。E-mail: ahtai1018@yahoo.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.004

R542.2

A

1002-266X(2017)17-0010-04

2016-12-05)