胃癌患者Toll樣受體4基因rs10759932、rs11536889多態性觀察

衛美蓉，施喜俠，劉晶，王笑峰

(1西京學院，西安710123；2西安高新醫院；3深圳市南山區第六人民醫院；4青島大學)

胃癌患者Toll樣受體4基因rs10759932、rs11536889多態性觀察

衛美蓉1，施喜俠2，劉晶3，王笑峰4

(1西京學院，西安710123；2西安高新醫院；3深圳市南山區第六人民醫院；4青島大學)

目的觀察胃癌及EB病毒(EBV)陽性胃癌患者Toll樣受體4(TLR4)基因rs10759932、rs11536889多態性，探討其與胃癌和EBV相關胃癌(EBVaGC)易感性的關系。方法采用PCR結合限制性片段長度多態性(RFLP)檢測160例胃癌患者[胃癌組，包括41例EBVaGC患者和119例EBV陰性(EBVnGC)患者]、100例健康體檢者(對照組)TLR4基因rs10759932、rs11536889位點多態性。結果①TLR4基因rs10759932位點多態性：胃癌組基因型TT者90例、TC者53例、CC者7例，等位基因T頻數233(77.7%)、等位基因C頻數67(22.3%)。對照組基因型TT者42例、TC者40例、CC者18例，等位基因T頻數124(62.0%)、等位基因C頻數76(38.0%)。胃癌組TT基因型頻率明顯高于對照組(χ2=14.373,P<0.01)。與攜帶CC基因型者相比，攜帶TT基因型者罹患胃癌的風險增加(OR=5.510,95%CI為2.138～14.202，P<0.01)。胃癌組和對照組等位基因T、C頻率比較有統計學差異(χ2=14.423，P<0.01)。個體攜帶等位基因C可以降低罹患胃癌的風險(OR=2.131,95%CI為1.437～3.161,P<0.01)。胃癌組EBVaGC和EBVnGC患者基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。②TLR4基因rs11536889位點多態性：胃癌組和對照組、胃癌組EBVaGC和EBVnGC患者基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。結論TLR4基因rs10759932位點多態性與胃癌易感性有關，攜帶C等位基因者罹患胃癌的風險較低。TLR4基因rs11536889位點多態性與胃癌易感性無關。TLR4基因rs10759932、rs11536889位點多態性與胃癌是否合并EBV感染無關。

胃癌；EB病毒；Toll樣受體4；單核苷酸多態性

胃癌的發病過程極其復雜，是多步驟、多因素參與形成的。一方面是因為機體DNA長期暴露于不利的環境中導致DNA損傷，從而引發癌基因激活和(或)抑癌基因失活，最終促使腫瘤的形成[1]；另一方面原因為基因存在多態性，使得部分個體由于攜帶腫瘤易感基因，即使較少地暴露于危險環境因素下也發病[2]。在胃癌細胞中，Toll樣受體4(TLR4)呈現高表達，且對胃癌的發生發展產生重要影響[3]。EB病毒(EBV)在多種腫瘤的發生過程中發揮促進作用，是一種重要的腫瘤相關病毒[4]。rs10759932、rs11536889是TLR4基因容易出現單核苷酸多態性的位點。TLR4基因rs10759932、rs11536889多態性與胃癌及EBV相關胃癌(EBVaGC)易感性的關系目前尚不明確。2015年10月～2016年2月，本研究觀察了胃癌及EBVaGC患者TLR4基因rs10759932、rs11536889位點多態性，探討其與胃癌和EBVaGC易感性的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇EBVaGC患者41例為EBVaGC組，其中男22例、女19例，年齡41～76歲；臨床分期為Ⅰ期14例，Ⅱ期17例，Ⅲ期10例；病理分級為T1N06例，T1N18例，T1N26例，T2N16例，T3N05例，T2N2M010例。選擇EBV陰性胃癌(EBVnGC)患者153例為EBVnGC組，其中男81例、女72例，年齡39～74歲；臨床分期為Ⅰ期53例，Ⅱ期60例，Ⅲ期40例；病理分級為T1N021例，T1N132例，T1N226例，T2N114例，T3N020例，T2N2M040例。EBVaGC與EBVnGC患者在性別、年齡、臨床分期、病理分級等方面有可比性。將EBVaGC、EBVnGC組患者合并為胃癌組，另選取性別、年齡匹配的100例健康體檢者為對照組。排除感染、自身免疫病、腫瘤患者。入組者均來自山東地區漢族人群，且已簽署知情同意書。

1.2 TLR4基因多態性檢測方法 采用苯酚、氯仿-異戊醇抽提法提取所有受檢者胃癌組織及血液中的DNA，TE緩沖液(pH 8.0)溶解干燥后的DNA，并于4 ℃冰箱保存備用。采用PCR結合限制性片段長度多態性(RFLP)技術檢測TLR4基因rs10759932、rs11536889多態性。① rs10759932位點。PCR反應體系為25 μL，其中包括10×Buffer 2.5 μL，上下游引物(0.5 μmol/L)各1.25 μL，dNTPs (0.2 mmol/L)2.0 μL，DNA 模板3 μL，Taq DNA聚合酶1.0 U。PCR正向引物5′-TTTGTATAATTTGACTACCATTGCGT-3′，反向引物 5′- CATTTT-TTCACATCTTCACCAGC-3′。循環條件為：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min共40個循環，最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠其中含溴化乙錠(0.5 μg/mL)中電泳，凝膠成像記錄電泳結果。PCR實驗中每次反應均用無菌雙蒸水設立陰性對照。PCR擴增完成后，將5 μL PCR產物與0.5 μL限制性內切酶HhaI混合并加入10×Buffer 2.5 μL及純水共25 μL混勻后瞬時離心，于37 ℃溫育15 min進行酶切反應。酶切產物用4.0%的聚丙乙烯垂直凝膠電泳分離，溴化乙錠染色后成像系統記錄電泳結果。GC↓GC序列為限制性內切酶HhaI的識別部位。②rs11536889位點。兩對引物同時加入PCR反應體系進行擴增，直接鑒定基因型[5]。PCR正向引物1序列5′-TTTGATGGACCTCTGAATCTC-3′，反向引物1序列 5′-TTTTCTCAATGATAACATCCACTC-3′；PCR正向引物2序列5′- CTTGACCACATTTTGGGAAC-3′，反向引物2序列5′-TTCCAATTTCTCTATATCCTTGATGA-3′。該位點的PCR反應體系及反應條件和TLR4 rs10759932位點相同。PCR反應完成后，利用2.5% 瓊脂糖凝膠電泳分離12 μL PCR產物，用溴化乙錠染色后凝膠成像系統觀察并記錄實驗結果。

將25 μL PCR產物送華大基因有限公司采用末端終止法進行雙向測序。測序結果用DNAStar(Larsergene7.0)及Chromas軟件進行分析處理，并查找基因庫中野生型TLRs相應的基因序列，與測序結果進行對比，對PCR-RFLP鑒定結果進一步驗證。rs10759932位點：PCR產物酶切后電泳得到一條139 bp條帶者為純合野生基因型TT，得到117、22 bp兩條帶者為突變基因型CC，得到117、22、139 bp三條帶者為雜合基因型TC。基因測序結果與上述判斷相符。rs11536889位點：PCR產物酶切后電泳得到397、184 bp兩條條帶者為純合子野生基因型GG，得到397、256 bp兩條條帶者為純合突變基因型CC，得到397、256、184 bp三條擴增條帶者為雜合基因型GC。基因測序結果證實上述判斷。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。采用χ2檢驗或Fisher檢驗比較胃癌組與對照組、EBVnGC與EBVaGC患者基因型及等位基因頻率的分布，并計算比值比(OR)及P值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

所有受檢者中TLR4基因rs10759932、rs11536889基因型和等位基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.1 TLR4基因rs10759932位點多態性與胃癌及EBV感染的關系 胃癌組基因型TT者90例、TC者53例、CC者7例，等位基因T頻數233(77.7%)、等位基因C頻數67(22.3%)。對照組基因型TT者42例、TC者40例、CC者18例，等位基因T頻數124(62.0%)、等位基因C頻數76(38.0%)。胃癌組TT基因型頻率明顯高于對照組(χ2=14.373,P<0.01)。與攜帶CC基因型者相比，攜帶TT基因型者罹患胃癌的風險增加(OR=5.510,95%CI為2.138～14.202，P<0.01)。胃癌組和對照組等位基因T、C頻率比較有統計學差異(χ2=14.423，P<0.01)。個體攜帶等位基因C可以降低罹患胃癌的風險(OR=2.131,95%CI為1.437～3.161,P<0.01)。胃癌組EBVaGC患者基因型TT者19例、TC者18例、CC者3例，等位基因T頻數56(70.0%)、等位基因C頻數24(30.0%)；EBVnGC患者基因型TT者71例、TC者35例、CC者4例，等位基因T頻數177(80.5%)、等位基因C頻數43(19.5%)。EBVaGC和EBVnGC患者基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。

2.2 TLR4基因rs11536889位點多態性與胃癌及EBV感染的關系 胃癌組基因型為GG者95例、GC者54例、CC者4例，等位基因G頻數244(79.7%)、C頻數62(20.3%)。對照組基因型為GG者64例、GC者34例、CC者2例，等位基因G頻數162(81.0%)、C頻數38(19.0%)。兩組基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。胃癌組EBVaGC患者基因型GG者23例、GC者18例、CC者2例，等位基因G頻數64(74.4%)、等位基因C頻數22(25.6%)；EBVnGC患者基因型GG者72例、GC者36例、CC者2例，等位基因G頻數180(81.8%)、等位基因C頻數40(18.2%)。EBVaGC和EBVnGC患者基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。

3 討論

研究表明，TLRs基因某些位點多態性與腫瘤的遺傳易感性、臨床分期及患者預后密切相關[6]。其中包括位于9號染色體上，其cDNA全長為3 811 bp，包含4個外顯子的TLR4基因。大量有關TLR4基因多態性的研究結果表明，其各位點的多態性可能與腫瘤的易感性有關[7～9]。例如，Garza-Gonzalez等[10]研究發現TLR4基因多態性(Asp299Gly、Thr399Ile)可能會導致持久的炎癥，導致其攜帶者癌癥的易感性明顯增加；Hishida等[11]發現TLR4 rs11536889基因的多態性可以增加幽門螺桿菌陽性胃癌的易感性；Huang等[12]研究結果顯示TLR4 rs10759932位點基因的多態性與胃癌易感性有關；還有研究發現TLR4基因rs11536889多態性和前列腺癌的易感性相關[13]。這些研究結果均說明人類一些炎癥、惡性腫瘤的易感性可能與TLR4基因多態性之間存在某種聯系。

本研究結果顯示，TLR4基因rs10759932位點多態性與胃癌易感性有關，攜帶C等位基因者罹患胃癌的風險較低。此結果與Huang等[12]的研究結論一致。然而本研究結果顯示，TLR4基因rs11536889位點多態性與胃癌易感性無相關性。之前有關該位點多態性的研究結果也有相同結論，例如Zhang等[14]報道TLR4基因rs11536889位點多態性與罹患胃癌的易感性無相關性。rs11536889位點位于TLR4基因的中心部位，因此該位點的多態性可能影響造成其mRNA的不穩定。有研究結果顯示，在華人中攜帶等位基因C可以明顯增加胃癌的易感性，但是在其他亞洲人和高加索人群中的相同研究卻得出不同的結論[15]。還有學者研究發現該位點的多態性不僅與胃部腫瘤有關，而且與其他的一些炎癥相關性腫瘤關系密切[16]。以上研究結論均提示基因多態性只是有關胃癌易感性的眾多風險因素中的一個。

慢性炎癥、免疫抑制或免疫刺激等因素均可以促進EBV活化和復制。微生物的內源性損傷相關模式分子和病原相關分子模式可通過刺激TLRs，從而激活免疫系統，進一步促進EBV陽性細胞的擴增[17]。研究證實在某些疾病發展過程中TLRs與EBV可以相互作用[18]。Yang等[19]發現TLR4基因T399I，其攜帶CT/TT基因型的人群罹患鼻咽癌的風險較高。然而本研究結果則顯示，TLR4 rs11536889、rs10759932位點基因的多態性與EBV感染無相關性。這可能是由于EBVaGC組織中EBV編碼基因的表達與其他EBV相關腫瘤例如鼻咽癌、Burkitt′s淋巴瘤等有一定的差異。有研究發現TLRs中部分成員通過激活LMP1而產生相關細胞因子，調節一系列相關基因的表達，從而導致疾病的發生。已有研究表明在EBVaGC組織中檢測不到EBV細胞轉化基因即潛伏膜蛋白(LMP1)，證明其編碼基因是不能夠表達的。這是因為EBV以Ⅰ型潛伏的形式存于EBVaGC中，即不能夠表達LMP1。研究也進一步證明了EBVaGC具有其獨特性，同時也提示TLRs基因多態性在EBVaGC中所發揮的作用與其在其他腫瘤組織中所發揮的作用是存在一定差異的。

總之，本次試驗結果證明了TLR4 rs10759932位點的多態性與胃癌易感性有密切的關系，然而rs11536889位點的多態性與胃癌易感性無關。且TLR4基因 rs10759932、rs11536889位點多態性與EBV感染無關。但是本研究仍存在樣本量較小等缺陷。因此我們應擴大EBVaGC樣本量，增加慢性胃部炎癥患者作為病例對照，且對TLR4編碼基因的其他多態性位點進行檢測，同時結合外界環境因素和宿主因素對胃癌形成的影響，進一步明確TLR4 基因多態性與胃癌以及EBV感染是否具有協同作用。

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施喜俠(E-mail: 13569535@qq.com)

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2017-05-12)