姜黃素對PD模型細胞活性氧簇水平及沉默信息調控因子3表達的影響

馬振凱，李夢楠，白宏英

(鄭州大學第二附屬醫院，鄭州450014)

姜黃素對PD模型細胞活性氧簇水平及沉默信息調控因子3表達的影響

馬振凱，李夢楠，白宏英

(鄭州大學第二附屬醫院，鄭州450014)

目的探討姜黃素對魚藤酮誘導的帕金森病(PD)模型SH-SY5Y細胞活性氧簇(ROS)水平及沉默信息調控因子3(Sirt3)表達的影響，為PD的臨床治療提供依據。方法將體外培養的SH-SY5Y細胞分為姜黃素1組、姜黃素2組、姜黃素3組、姜黃素4組、模型組和對照組。姜黃素1、2、3、4組先分別加入0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L的姜黃素培養4 h，然后加入0.1 μmol/L魚藤酮共同培養24 h；模型組直接加入0.1 μmol/L魚藤酮培養24 h；對照組培養基內不加任何藥物培養24 h。采用 DCFH-DA染色法檢測各組ROS水平，RT-PCR法測定Sirt3 mRNA相對表達量，Western blotting法測定Sirt3蛋白相對表達量。結果ROS水平：模型組高于對照組(P<0.05)，姜黃素2組<姜黃素1組<模型組(P均<0.05)，但姜黃素3組、姜黃素4組、模型組兩兩比較P均>0.05。Sirt3 mRNA和蛋白相對表達量：模型組低于對照組(P均<0.05)，姜黃素2組>姜黃素1組>模型組(P均<0.05)，但姜黃素3組、姜黃素4組、模型組兩兩比較P均>0.05。結論姜黃素可降低SH-SY5Y細胞ROS水平，上調Sirt3表達；此作用姜黃素濃度為1.0 μmol/L時最為明顯。

帕金森病；姜黃素；SH-SY5Y細胞；魚藤酮；活性氧簇；沉默信息調控因子3

帕金森病(PD)是老年常見神經變性疾病。氧化應激導致的活性氧簇(ROS)過度生成引起多巴胺神經元凋亡可能是PD發生的重要原因[1～3]。研究發現，沉默信息調控因子3(Sirt3)能使線粒體內相關的乙酰化蛋白脫乙酰基，通過增加 ROS清除酶活性和穩定線粒體功能抑制線粒體內 ROS的蓄積[4,5]。姜黃素是從姜黃中分離出的多酚化合物。本課題組前期研究發現，預先應用姜黃素對魚藤酮誘導的PD模型細胞有保護作用，我們推測這種保護作用可能與氧化應激有關。為驗證這一推測，2015年10月～2016年5月本研究觀察了姜黃素對魚藤酮誘導的PD模型SH-SY5Y細胞ROS水平及Sirt3表達的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞株為本實驗室自行傳代。姜黃素、魚藤酮購自北京鼎國昌盛生物技術公司，胰蛋白酶、DMEM-H培養基、PBS購自美國HyClone公司，小牛血清購自美國GEMINI公司，抗Sirt3一抗購自美國Santa Cruz公司，HRP標記羊抗兔二抗購自美國Zymed公司，DNA反轉錄試劑盒、SYBR Ⅰ RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 細胞分組干預及PD模型細胞的制作 SH-SY5Y細胞置于含15%小牛血清的DMEM-H培養液中，于37 ℃、5% CO2RT-PCR培養箱中培養。隔天換液，傳代。取對數生長期SH-SY5Y細胞胰蛋白酶消化后，用培養基調整細胞密度為1×105個/mL,接種于6孔板內培養，待細胞進入對數生長期后分為姜黃素1組、姜黃素2組、姜黃素3組、姜黃素4組、模型組和對照組。姜黃素1、2、3、4組細胞先加入0.1 μmol/L魚藤酮共同培養24 h，再向各組加入不同濃度的姜黃素使其終濃度分別達到0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L；模型組直接加入0.1 μmol/L魚藤酮培養24 h。對照組培養基內不加任何藥物培養24 h。

1.3 細胞ROS水平檢測 采用DCFH-DA染色法和流式細胞術。收集各組細胞于15 mL錐形離心管內，4 ℃、1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入預冷的PBS 1 mL后移入5 mL EP管中再次離心，去上清液后加入1 mL GENMED 染色工作液吹打均勻后37 ℃溫水浴中避光孵育20 min，500 r/min離心5 min加入GENMED保存液置于冰槽內，采用流式細胞術檢測各組細胞ROS水平。各組結果均以平均熒光強度表示。

1.4 細胞Sirt3 mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。先用TRIzol法提取各組細胞總RNA。取總RNA 1 μg按照TaKaRa公司cDNA合成試劑盒說明書操作在普通PCR儀上反轉錄合成cDNA，反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，降溫到4 ℃，于-20 ℃保存。用相應的PCR引物在ABI7500 fast system 定量PCR儀器上進行熒光定量PCR。20 μL的PCR反應體系組成如下：cDNA模板2 μL，SYBR(2×)10 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，上下游引物各0.5 μL，無RNA酶水補至20 μL。每組設置3個復孔，并分別設置陰性對照。內參基因GAPDH上游引物為5′-ACTCCTCCACCTTTGACGC- 3′，下游引物為5′-GCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′；SIRT3上游引物為5′-CCCGACTGCTCATCAACC-3′，下游引物為5′-CAGCCCAGAAGCTCCACTA-3′。反應條件:95 ℃ 10 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 25 s；循環40次。采用2-ΔΔCT法計算Sirt3 mRNA相對表達量。

1.5 細胞Sirt3蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞并提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度定量試劑盒測定蛋白濃度后調整每孔蛋白量為30 μg，按相應比例將其與上樣緩沖液混勻后100 ℃變性5 min，行SDS-PAGE凝膠電泳后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST封閉，一抗(稀釋比例1∶800)4 ℃孵育過夜，用TBST液洗膜4次×5 min，二抗(稀釋比例1∶1 000)室溫下孵育2 h，TBST洗膜5 min×4次后于暗室進行ECL顯影，Quantity One圖像分析軟件檢測Sirt3蛋白條帶的積分光密度值，即相對表達量。

2 結果

2.1 各組ROS水平比較 姜黃素1組、姜黃素2組、姜黃素3組、姜黃素4組、模型組、對照組ROS水平分別為172.13±33.71、74.54±7.99、228.63±22.40、233.52±15.33、239.79±35.32、40.28±7.75。ROS水平模型組高于對照組(P<0.05)，姜黃素2組<姜黃素1組<模型組(P均<0.05)，但姜黃素3組、姜黃素4組、模型組兩兩比較P均>0.05。

2.2 各組Sirt3 mRNA相對表達量比較 姜黃素1組、姜黃素2組、姜黃素3組、姜黃素4組、模型組、對照組Sirt3 mRNA相對表達量分別為5.07 ±0.30、6.62±0.71、1.76±0.32、1.87±0.40、2.17±0.15、7.45±0.34。Sirt3 mRNA相對表達量模型組低于對照組(P<0.05)，姜黃素2組>姜黃素1組>模型組(P均<0.05)，但姜黃素3組、姜黃素4組、模型組相比P均>0.05。

2.3 各組Sirt3蛋白相對表達量比較 姜黃素1組、姜黃素2組、姜黃素3組、姜黃素4組、模型組、對照組Sirt3蛋白相對表達量分別為0.43±0.05、0.75±0.09、0.17±0.14、 0.17±0.08、0.14±0.03、0.25±0.05。Sirt3蛋白相對表達量模型組低于對照組(P<0.05)，姜黃素2組>姜黃素1組>模型組(P均<0.05)，但姜黃素3組、姜黃素4組、模型組兩兩比較P均>0.05。

3 討論

PD的發病機制包括氧化應激、線粒體功能障礙、泛素-蛋白酶體功能障礙、包涵體形成等,最終導致黑質多巴胺能神經元喪失而發病[8]。Jung 等[4]研究發現，具有呼吸功能的PD細胞ROS過量產生；何建成等[9]發現，PD大鼠模型腦組織中清除自由基的相關酶，如過氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等含量明顯降低，表明PD模型大鼠清除氧自由基的能力降低，ROS在組織細胞內蓄積而誘發PD。氧化應激導致的神經元凋亡在PD的發病過程中起重要作用[10，11]。目前對抗氧化應激已成為治療PD的重要方法之一。魚藤酮可選擇性抑制線粒體復合物Ⅰ, 誘發ROS的過度生成，而ROS通過導致蛋白質變性、改變線粒體膜電位、導致Ca2+失調等一系列途徑介導細胞凋亡。

姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種酚性色素，是姜黃的重要活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、調節血脂等廣泛的藥理作用[12]。已有實驗證實姜黃素對魚藤酮誘導的PC12細胞有保護作用[13]。但其對魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞是否具有保護作用及其機制尚未見有關報道。本研究結果顯示，模型組ROS水平明顯升高，而0.5、1.0 μmol/L姜黃素可明顯拮抗魚藤酮誘導的細胞損傷，顯著降低細胞內ROS水平，清除部分氧自由基；但姜黃素濃度超過1.0 μmol/L后細胞內ROS水平與模型組比較差異無統計學意義。崔群力等[14]研究發現，姜黃素濃度過高時并不能起到保護作用，可能是因為其濃度過高時本身可作為應激因素激活細胞內一系列下游分子，如熱休克蛋白、α-突觸核蛋白等。當姜黃素濃度大于10 μmol/L時將會直接損傷細胞。

去乙酰化酶Sirt3是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD) 的Ⅲ類去乙酰化酶，屬于進化上高度保守的Sirtuin 家族成員之一[5]。Sirt3能通過其去乙酰化激活氨基酸代謝[15]、脂肪酸代謝、三羧酸循環、氧化呼吸電子傳遞鏈等關鍵酶活性，代償性增強線粒體氧化呼吸功能，減少ROS的生成[16]；亦能提高氧自由基清除酶的活性，增強抗氧化系統的功能。如Sirt3可使乙酰化的錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)脫乙酰基，增強Mn-SOD活性；對乙酰化的Idh2脫乙酰基，提高NADPH水平[17]；提高線粒體中谷胱甘肽還原型/氧化型(GSH/GSSG)比例；對乙酰化的Foxo3a脫乙酰基，提高依賴于Foxo3a的CAT mRNA表達水平[18]。本研究結果顯示，模型組細胞Sirt3 mRNA和蛋白表達均明顯降低；0.5、1.0 μmol/L的姜黃素可提高模型組Sirt3表達水平，這可能與上述代償增強線粒體功能及增強抗氧化系統有關；而5.0、10.0 μmol/L姜黃素干預細胞，細胞Sirt3表達并沒有明顯升高，說明高濃度的姜黃素本身可作為一種應激源，對細胞線粒體產生直接損傷。

綜上所述，姜黃素可降低SH-SY5Y細胞ROS水平，上調Sirt3表達；1.0 μmol/L姜黃素的上述作用最為明顯。

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河南省科學技術廳基礎與前沿技術研究計劃項目(14230-0410461)。

白宏英(E-mail: hybai@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.014

R742.1

A

1002-266X(2017)40-0050-03

2016-09-22)