鮑曼不動桿菌外膜蛋白的研究進展

李興國，溫漢春

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

鮑曼不動桿菌外膜蛋白的研究進展

李興國，溫漢春

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

鮑曼不動桿菌是一種重要的革蘭陰性條件致病菌，近年來由于各種抗生素的廣泛應用導致其形成了多重耐藥菌和泛耐藥菌。目前對于該菌外膜蛋白的研究相對較少。鮑曼不動桿菌相關的外膜蛋白，包括外膜蛋白A、外膜蛋白33-36、外膜蛋白W、外膜蛋白22、外膜蛋白AIS-1969等均為鮑曼不動桿菌致病毒力因子。外膜蛋白眾多，且很多具有高度的保守性和免疫原性，研究這些外膜蛋白將會有利于人類找到合適的靶點構建疫苗，為人類的抗感染治療增加新的手段。

鮑曼不動桿菌；外膜蛋白；細菌耐藥性

鮑曼不動桿菌(AB)是一種需氧、不發酵，能夠在不同環境中存活的條件致病菌。上個世紀90年代以前，AB對多數抗生素敏感且對人類無致病性。然而進入21世紀，人們發現AB可以引起多種院內感染性疾病如呼吸機相關性肺炎、菌血癥、腦膜炎等。雖然很多學者對于AB流行病學、耐藥機制等研究做了很大貢獻，但對于其致病機制、表面蛋白及疫苗學的研究卻相對較少。本文就AB外膜蛋白的研究進行以下綜述。

1 膜蛋白A(OmpA)

OmpA是目前研究最為深入的AB致病毒力因子。該蛋白有多種功能，不僅可以促進菌體對宿主細胞的黏附、侵襲，誘導細胞凋亡，同時也可以刺激宿主的免疫反應。

1.1 OmpA的毒力效應 OmpA是一種低通透性孔蛋白。AB的OmpA屬于多聚合孔蛋白家族中的單聚體外膜孔蛋白[1]，與大腸桿菌OmpA和銅綠假單胞菌的OmpF相似，具有轉運小分子物質的功能。Lopes等[2]研究發現，AB的OmpA在細菌細胞膜表面所形成的孔道直徑約為2 nm，僅為大腸桿菌OmpF的1/70，說明OmpA所形成的孔道非常微小，因此其通透性較低。雖然OmpA孔道微小，但當OmpA基因被敲除后，基因缺失菌膜通透性降低[2]。這一研究表明OmpA是AB表面非常重要的孔道蛋白。

OmpA在菌體黏附和侵襲宿主細胞過程中扮演重要的角色。Luo等[3]研究顯示，OmpA不僅可以促進AB黏附于假絲酵母和人類肺上皮細胞(A549細胞)，同時也有助于AB侵入假絲酵母和肺上皮細胞體內，誘導其凋亡。研究者利用PCR技術測定了臨床分離AB毒力因子OmpA的表達情況，發現臨床菌株對A549細胞的黏附率與OmpA呈正相關關系[4]。這表明OmpA是AB重要的黏附相關因素。通過觀察AB對A549細胞的黏附，發現其入侵上皮細胞是通過一種類似拉鏈的機制，這是一種微絲管依賴的攝取系統[5]。構建OmpA基因失活菌株，用該菌來感染A549細胞，發現基因失活菌株對細胞的黏附和侵襲均顯著低于同源型野生菌株[6]。因此，可以推斷AB在黏附和侵襲上皮細胞的過程中，OmpA起重要作用。OmpA可以引起線粒體分解，誘導宿主細胞凋亡。當AB野生菌株感染HEp-2細胞后可以觀察到細胞線粒體分解、細胞凋亡[7]，但OmpA基因失活菌株感染HEp-2細胞后，細胞并沒有凋亡。研究者制備了純化的OmpA重組蛋白，并用該蛋白作用HEp-2細胞，發現重組蛋白定位于HEp-2細胞線粒體上，引發了大量的促凋亡因子如細胞色素C和凋亡誘導因子的釋放，激活了Caspase-3，進一步激活了Caspase-9，致使宿主細胞DNA降解[8]。這些說明OmpA可以進入宿主線粒體內并且啟動細胞凋亡機制。

1.2 OmpA對機體的免疫反應 OmpA既可以上調宿主免疫分子的表達，也可以影響宿主的免疫反應。為了分析OmpA對固有免疫反應的影響，研究者利用人工重組OmpA作用于人源性HEp-2細胞，結果OmpA引起了一系列基因差異性表達，如提高了免疫反應的信號傳導分子、Toll樣受體2和誘導型一氧化氮合酶等的表達，但卻并不能提高炎性因子和趨化因子的表達水平[9]。另有研究者使用OmpA侵染人樹突狀細胞(DC)，發現可以明顯活化DC，促進DC高表達細胞表面分子CD40、CD54、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ，同時誘導DC產生IL-12，增強DC的免疫反應能力[10]。Kunz 等[11]研究發現，OmpA刺激的DC可以激活CD4+T細胞，促進Th1極化相關細胞因子譜的表達。這些說明AB OmpA在刺激人類免疫系統反應的過程中發揮了重要作用。補體系統是人類固有免疫系統抵抗細菌感染的主要成分，而菌血癥是AB引起的常見院內感染性疾病。Podnos等[12]研究顯示，AB可以抵抗正常人血清補體系統介導的裂解作用。研究者通過基因突變技術構建了OmpA基因失活菌株，用人正常血清孵育該基因失活菌株一段時間后，該菌株多數被清除，而同源型野生菌株卻生存良好。表明OmpA與菌體介導的抗補體作用有很大關聯，這種關聯可能是該蛋白直接參與抗補體作用或者是參與其他抗補體相關的機制，但具體機制仍需進一步研究。總之，OmpA是AB比較重要的逃逸補體殺傷的表面蛋白。

1.3 OmpA相關的疫苗研究 Luo等[13]研究發現，OmpA是一種比較保守的外膜蛋白，其菌種間氨基酸同源性≥89%，因此菌種間蛋白差異較小。與人類細胞表面蛋白對比發現兩者同源性較低，通過不同的動物模型發現其免疫原性較好。此外通過蛋白質組學、二維電泳和質譜分析等技術發現，OmpA是AB外膜中含量最高的表面蛋白，因此可以考慮將其作為研制疫苗的候選抗原。Luo等應用純化的重組OmpA和佐劑氫氧化鋁通過靜脈注射免疫糖尿病小鼠，2 d后發現小鼠體內產生了高水平的抗OmpA抗體。當免疫后的小鼠感染多耐藥AB后其存活率明顯高于對照組小鼠，其不同組織細菌載量也明顯低于對照組。與此同時，研究者用抗OmpA抗體進行體外抗體活性實驗，發現抗OmpA抗體不是直接加強血清中補體介導的固有免疫來殺滅菌體，而是通過抗體介導的調理吞噬作用來殺滅菌體。此外，另有研究者用純化的AB OmpA作為抗原刺激小鼠鼻內黏膜，來誘導產生局部和全身黏膜抗體。經過一段時間刺激后，經OmpA免疫過的小鼠感染臨床多重耐藥AB后，其生存率明顯高于同期對照組。這表明OmpA具有很好的免疫原性，可以經局部誘導進而產生全身獲得性體液免疫。研究者檢測了感染者和健康者血清，發現體內抗OmpA抗體為IgG抗體，且效價較高[14]。說明OmpA不僅具有很好的免疫原性，而且可以通過不同的途徑誘導機體免疫。

2 外膜蛋白33-36(Omp33-36)

ABOmp33-36是一種典型的革蘭陰性菌外膜孔蛋白，它與碳青霉烯類抗生素的耐藥有關，在菌體中充當一種水通道蛋白[15]。Omp33-36可以隨外膜囊泡一起被分泌到菌體外，作用于宿主細胞發揮其致病效應。Rumbo等[15]研究顯示，Omp33-36可以誘導細胞凋亡。研究者用純化的Omp33-36作用于HEp-2細胞，顯微鏡下發現HEp-2細胞皺縮、胞膜內陷、染色質固縮。研究者構建了Omp33-36基因失活的菌株感染吞噬細胞，發現基因失活菌株介導的細胞凋亡率明顯低于同源型野生菌。此外在小鼠全身感染的模型中同樣發現，基因失活組小鼠病死率明顯低于同源型野生菌株。這表明Omp33-36是AB非常重要的一個毒力因子，其介導的細胞凋亡是其致病的主要機制。Omp33-36可以隨外膜囊泡分泌至菌體外，因此可以考慮將其作為一個靶點，研究相應的特異性抗體或相應的藥物阻止其與宿主細胞的作用，為抗感染治療帶來新的希望。

3 外膜蛋白W(OmpW)

OmpW是一個由183個氨基酸構成的疏水性孔蛋白，在已報道的AB中其同源性超過91%，且與銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的OmpW也具有很好的同源性[16]。OmpW不僅鑲嵌于外膜，也存在于細胞質中，與細菌多種功能有關。通過構建重組OmpW可以發現其形成了小分子通道，該通道與鐵離子的攝取有關，且屬于鐵調節子。當AB生長在鐵離子豐富的環境中，鐵載體不能表達，OmpW可以高表達并促進鐵的攝取[17]。這表明，OmpW是維持鐵離子在菌體內平衡的一種重要調節機制。既往研究表明，OmpW可以潛在地引起AB對替加環素和亞胺培南的耐藥性。Huang等[16]研究發現，OmpW可以轉運替加環素分子到外膜蛋白，但當OmpW缺失后并不能影響AB對替加環素和亞胺培南的敏感性。這說明OmpW可能參與了對替加環素和亞胺培南的耐藥機制，但并不是決定性成分。

4 外膜蛋白22(Omp22)

Omp22由217個氨基酸構成，具有一個甘氨酸拉鏈和一個與OmpA蛋白C-端相似的肽段，且該肽段可以與肽聚糖結合。研究者用人肺上皮細胞A549和腫瘤細胞293FT檢測Omp22的毒性，發現該蛋白并不黏附和侵襲宿主細胞，只在高濃度情況下抑制細胞的生長[18]。表明Omp22并不是細菌的毒力因子。Omp22經過折疊后具有免疫抗原表位，而且與人類蛋白質同源性極低，可以考慮將其作為疫苗候選抗原。研究者發現，經重組Omp22主動免疫的小鼠可以產生特異性高滴度的IgG抗體。隨后經主動和被動免疫試驗發現，經免疫后的小鼠其生存率增加、器官和外周血載菌量降低，血清中炎性細胞因子和趨化因子受到了抑制。這些研究表明，Omp22蛋白是一種新型值得開發的有效疫苗，可以通過其抗血清來控制AB的感染。

5 外膜蛋白AIS-1969(OmpAIS-1969)

AIS-1969是一種外膜蛋白，目前對其具體功能尚不清楚，但研究發現，其與BamA蛋白具有高度相似的三維結構。生物信息學分析表明，AIS-1969基因序列在AB中高度保守，因此研究者考慮將其作為疫苗研究的靶點[19]。研究者用純化的可溶性AIS-1969α重組蛋白通過腹腔攻毒感染途徑構建了動物主動和被動免疫模型，發現AIS-1969α免疫機體后可激發高效的保護性免疫應答，促進機體對AB的清除，抑制炎癥因子的表達，抑制AB感染所引起的病理損傷。這說明OmpAIS-1969具有很好的抗原性，可以考慮作為疫苗研發的靶點，但對于其具體功能需要做深入的研究。

目前AB耐藥率嚴重，已經對臨床大部分藥物耐藥，因此研制新的治療手段迫在眉睫。抗感染治療史上，很多微生物通過疫苗免疫促使人類免于病患。AB外膜蛋白眾多，且很多具有高度的保守性和免疫原性，因此，研究這些外膜蛋白將會有利于人類找到合適的靶點構建疫苗，為人類的抗感染治療增加新的手段。

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