染色體微陣列分析技術在不明原因智力低下患兒中的應用

陸芬，張躍，杜森杰，李紅英，張麗

(南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院，南京210008)

染色體微陣列分析技術在不明原因智力低下患兒中的應用

陸芬，張躍，杜森杰，李紅英，張麗

(南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院，南京210008)

目的 探討染色體微陣列分析(CMA)技術在不同原因智力低下患兒中的應用效果。方法 應用蘇州鉑金埃爾默公司提供的染色體微陣列芯片CGX-SNP對83例無明顯高危因素智力低下兒童進行基因組學研究。CMA分析所發(fā)現(xiàn)的染色體微缺失/微重復(CNVs)，進一步通過熒光原位雜交或?qū)崟r熒光定量PCR反應進行驗證。結(jié)果 38例(45.8%，38/83)患兒檢測到染色體異常。單親二倍體1例(1/38,2.6%)，三體2例(2/38,5.3%)，短臂單體1例(1/38,2.6%)，大片段重復3例(3/38,7.9%)，大片段缺失2例(2/38,5.3%)，CNVs 29例(29/38,76.3%),檢測到攜帶臨床致病性CNVs患兒 25例，檢出率達30.1%。結(jié)論 CMA檢查可及時發(fā)現(xiàn)智力低下患兒染色體異常，將檢出率提高至10%以上。

智力低下；染色體微陣列分析；染色體微缺失；染色體微重復；基因組學;兒童

智力低下(MR)是指智力損傷發(fā)生在發(fā)育時期、主要表現(xiàn)為智力明顯低于一般人水平，并伴有明顯的適應行為障礙[1]。2000年抽樣調(diào)查報告證實，我國0～6歲兒童智力殘疾現(xiàn)患率為0.931%，相當于我國有智力殘疾兒童1 300萬人，年均發(fā)現(xiàn)率為0.133%[2]，其中2/3原因不明。有調(diào)查發(fā)現(xiàn)，引起MR的先天、遺傳因素占11.21%[3]，居第4位，該因素引起的兒童MR程度以重型為主，提示在胎兒大腦發(fā)育初期，智力損害程度明顯高于后天致殘。同時該因素導致的MR治療效果差，因此需要合理的檢測手段確定MR的病因。由于傳統(tǒng)的細胞遺傳學分析方法如G顯帶染色體分析法，分辨率不高，僅能檢測較大的染色體畸變(>5 Mb)，因此，許多被診斷為“正常”結(jié)果的病例往往隱藏著染色體亞顯微結(jié)構(gòu)的異常。染色體微陣列(CMA)技術是最近發(fā)展起來的主要用于檢測染色體亞顯微缺失/微重復(CNVs)的一項技術，能將臨床致病性CNVs檢出率提高到10%以上[4]。本研究探討了其應用于MR患兒中的價值。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年6月～2017年3月在南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院就診的不明原因MR患兒83例，均符合Gesell發(fā)育診斷量表(Gesell Development Scale，北京修訂版，1986年)中的診斷標準。年齡3個月～4歲，其中男42例、女41例，適應行為能區(qū)發(fā)育商為24～73分、多數(shù)為40～54分。無相關家族史，83例患兒認知落后，所有家系均簽署知情同意書，同意參加全基因組CMA的檢測。本研究獲得南京兒童醫(yī)院倫理委員會批準。納入標準：不明病因的MR患兒指排除出生時、出生后相關高危因素，同時具有以下至少1個條件：伴其他系統(tǒng)畸形；具有典型面部特征或異常面容；母親具有異常妊娠史。排除標準：已明確的遺傳代謝性疾病(如苯丙酮尿癥、甲狀腺功能減退癥等)導致的MR。

1.2 診斷方法 采用Gesell發(fā)育診斷量表-中文修訂版進行診斷。Gesell發(fā)育量表包括評定兒童的大運動、精細動作、語言、社交、適應行為5個能區(qū)，計算每個能區(qū)的發(fā)育商(DQ)。DQ=DA/CA×100[DA：發(fā)育年齡(周)；CA：實際年齡(周)]；根據(jù)適應行為能區(qū)發(fā)育商高低判斷MR程度：輕度:55≤DQ≤75；中度:40≤DQ≤54；重度:25≤DQ≤39；極重度:DQ<25。

1.3 檢測方法 采集病史，同時采取患兒靜脈血2 mL，應用鉑金埃爾默DNA提取試劑盒提取基因組DNA，所用的芯片為蘇州鉑金埃默公司提供的CGX-SNP芯片。CMA分析所發(fā)現(xiàn)的CNVs都進一步通過熒光原位雜交或?qū)崟r熒光定量PCR反應進行驗證。對所得的原始數(shù)據(jù)應用蘇州鉑金埃爾默數(shù)據(jù)庫進行分析。參照國際基因組CNV多態(tài)性數(shù)據(jù)庫DGV、UCSC Genome Browser、DECIPHER以及ISCA數(shù)據(jù)庫及相關文獻判讀CNV。嚴格按照美國醫(yī)學遺傳學會的指南[5]，將CNVs分為4個等級：臨床致病性CNVs，臨床可能致病性CNVs，臨床意義不確定性CNVs，良性CNVs。

2 結(jié)果

本研究中，MR患兒83例，染色體異常38例(38/83，45.8%)。單親二倍體1例(1/38,2.6%)，三體2例(2/38,5.3%)，臂單體1例(1/38,2.6%)，大片段重復3例(3/38,7.9%)，大片段缺失2例(2/38,5.3%)，CNVs 29例(29/38,76.3%)。

根據(jù)CMA結(jié)果解讀，29例CNVs患兒中，攜帶臨床致病性CNVs 25例(25/29,89.3%)，攜帶臨床意義不能確定性CNVs 4例(4/29,13.7%)。25例攜帶臨床致病性CNVs的患兒中染色體微缺失17例(17/25,68.0%)，微重復4例(4/25,16.0%),微重復+微缺失4例(4/25,16.0%)。患兒CNVs分布于多個不同的染色體區(qū)域，分別為X染色體4例(4/25,16.0%)、1號染色體3例(3/25,12.0%)、2號染色體2例(2/25,8.0%)、7號染色體2例(2/25,8.0%)、15號染色體2例(2/25,8.0%)、17號染色體2例(2/25,8.0%)，其余14例(10/25,40.0%)為散發(fā)CNVs。

25例攜帶臨床致病性CNVs的患兒中Angelman綜合征/Prader-Willi 綜合征2例(15q11.2q13.1區(qū)域微缺失)、Wolf-Hirschhorn綜合征1例(4p16.3區(qū)域微缺失)、Miller-Dieker綜合征1例(17p13.3區(qū)域微缺失)、Williams綜合征1例(7q11.23區(qū)域微缺失)、Waardenburg綜合征1例(2q35-q36.1區(qū)域微缺失)、1p36缺失綜合征1例(1p36.31-p36.33微缺失)、MECP2重復綜合征1例(Xq28區(qū)域441.88 kB的重復)，其余17例未明確提示某種CNVs。

本研究共83例患兒，25例患兒檢測到攜帶臨床致病性CNVs，檢出率達30.1%。我們進一步對攜帶臨床致病性CNVs中患兒其中3例的父母樣本進行了CMA檢測，結(jié)果顯示2例患兒的CNVs遺傳自健康父母中的一方，1例患兒的CNVs為新發(fā)變異。

3 討論

MR作為一組表型、基因型高度異質(zhì)性的疾病，遺傳病因復雜。傳統(tǒng)的細胞遺傳學分析方法如G顯帶染色體分析法，其分辨率不高，僅能檢測較大的染色體畸變，CMA是最近發(fā)展起來的主要用于檢測染色體CNVs的一項技術，能將CNVs檢出率提高到10%以上。目前CMA主要有兩大平臺。一種是比較基因組雜交芯片(aCGH)，其基本原理是將待測樣本DNA與正常對照樣本DNA分別用不同的熒光標記，通過與芯片上固定探針進行競爭性雜交獲得定量的拷貝數(shù)檢測結(jié)果；另外一種是單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片(SNP array)，其基本原理是將探針連接在微珠上，然后將攜帶探針的微珠隨機黏附在芯片上，待測樣本DNA和探針進行雜交及單堿基延伸，通過對熒光信號掃描，分析待測樣本CNV及基因型，該平臺在分析患者的基因組時不需要正常對照樣本[6]。通過aCGH技術能夠準確地檢出CNV，而SNP array除了能夠檢出CNV外，還能夠檢測出大多數(shù)的單親二倍體和一定比例的嵌合體[7]。同時涵蓋CNV和SNP的芯片具備雙重優(yōu)勢，在檢測的敏感性、特異性、可靠性等方面得到很大提高。

美國婦產(chǎn)科學會2013年版指南[8]提出，“如產(chǎn)前發(fā)現(xiàn)超聲異常，CMA檢測方法最為有益”，CMA可替代傳統(tǒng)核型分析。2016年7月《中華兒科雜志》發(fā)布了《染色體基因組芯片在兒科遺傳病的臨床應用專家共識》[9]，為CMA在我國的應用提供了指南。目前國內(nèi)外CMA在產(chǎn)前診斷中應用較廣泛，Shaffer等[10～12]通過大量產(chǎn)前診斷樣本(主要來自羊水、流產(chǎn)樣本等)檢測提示有臨床意義的CNVs檢出率上升為6.0%～6.5%。常亮等[13]通過采用SNP array及染色體核型分析對2012年7月～2013年12月在北京大學第三醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的141例產(chǎn)前診斷為高危孕婦進行的對比分析，發(fā)現(xiàn)染色體核型分析異常率為6.4%，SNP array異常率為11.3%，兩種檢測技術檢測出的異常核型率比較差異有統(tǒng)計學意義。吳曉麗等[14]采用CMA技術對88例染色體核型分析正常的先天性心臟病胎兒進行了檢測，發(fā)現(xiàn)14例(16%)胎兒CNV結(jié)果為臨床致病性CNV。這些研究均表明CMA在產(chǎn)前診斷中應用廣泛，且陽性率高。CMA可以作為產(chǎn)前診斷標準檢測的一部分應用于臨床。國內(nèi)劉欣等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，CMA對各種類型神經(jīng)發(fā)育性疾病患兒的分子診斷率并不一致。其中，CMA對MR患兒的分子診斷率最高，達26.3%。

本研究對83例MR患兒進行了CMA的檢測，共檢測出25例患兒攜帶臨床致病的CNVs，檢出率為30.1%。明顯高于研究[6]報道的15%～20%的檢出率。分析可能原因為本研究病例數(shù)相對較少，增加了染色體基因CNVs異常檢出率，需進一步加強病例收集。25例攜帶臨床致病的染色體微失衡患兒，其中16例伴有面容特殊或者其他系統(tǒng)畸形，所以臨床上MR同時伴有面容特殊及其他系統(tǒng)畸形患兒應首先選擇CMA。

目前臨床上常見的CNVs綜合征至少有67種,如Angelman 綜合征、Prader-Willi 綜合征、Wolf-Hirschhorn 綜合征、DiGeorge 綜合征、Miller-Dieker 綜合征、Williams綜合征等。國內(nèi)外多個研究結(jié)果顯示，臨床致病性CNVs患兒中，Prader-Willi綜合征/Angelman綜合征(PWS/AS)的所占比例最高[16]。但本研究提示，X染色體臨床致病的CNVs最高，1號染色體臨床致病CNVs次高，PWS/AS的所占比例位于第3位，考慮可能與本研究病例數(shù)少有關。本研究未發(fā)現(xiàn)DiGeorge綜合征患兒。

國外多個研究表明，Williams綜合征、Miller-Dieker綜合征、Wolf- Hirschhorn 綜合征、1p36缺失綜合征、Waardenburg綜合征Ⅰ型均具有特殊面容，且各自具有特征性臨床表現(xiàn)，但目前國內(nèi)相關研究較少，對一些面容特殊合并MR兒童建議盡早完善CMA助診,對于診斷、判斷預后及優(yōu)生優(yōu)育指導有重要意義。

本研究結(jié)果也表明，CNVs在中國兒童MR患兒中發(fā)病率高，這一結(jié)果肯定了CMA技術的優(yōu)勢，但目前仍存在一些挑戰(zhàn)，如對照數(shù)據(jù)庫的缺乏和臨床意義未知的CNVs沒法解釋等。本研究29例CMA陽性患兒中就有4例(13.8%)臨床意義不明。但從研究的角度，隨著病例的積累及數(shù)據(jù)庫的不斷完善，這些臨床意義不明確變異最終可能成為與疾病相關的新的致病區(qū)域，為以后的分析提供拷貝數(shù)多態(tài)性參考。

對面容異常、MR、生長發(fā)育緩慢等患兒進行CMA檢查，可及時發(fā)現(xiàn)染色體異常。從優(yōu)生考慮,CMA檢測對患兒家庭有明顯指導意義,比如本研究內(nèi)有4例患兒存在2處CNVs，根據(jù)結(jié)果建議患兒父母進一步完善核型分析，以判斷患兒CNV是否來自父母，或源于父母的染色體平衡易位，評估再發(fā)風險。又如MECP2重復綜合征，該患兒家族譜系中存在該變異，有必要對家族中其他成員進行遺傳學檢測，為家族中可能的攜帶者進行遺傳咨詢和必要的遺傳學檢測,評估子代的發(fā)生風險。但是目前染色體芯片不能檢測染色體平衡易位(相互易位、羅賓遜易位、倒位、平衡性插入等)，且染色體嵌合性檢測精確性尚未確立，同時會檢出臨床意義不明的CNVs。對于高度懷疑染色體易位患兒建議完善染色體核型分析。CMA技術不能檢測單基因病，懷疑單基因病患兒應首選單基因檢測。

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張躍(E-mail：feiyuezhang@126.com)

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