NF-κB和HBD-2的表達(dá)情況與宮腔粘連的相關(guān)性分析

姚雅儷 鄧曼丹 李毅

·論著·

NF-κB和HBD-2的表達(dá)情況與宮腔粘連的相關(guān)性分析

姚雅儷 鄧曼丹 李毅

目的 探討核因子κB(NF-κB)和β-防御素2(HBD-2)表達(dá)與宮腔粘連的關(guān)系。方法 選取治療的51例宮腔粘連患者的子宮內(nèi)膜作為觀察組，同時(shí)選取42例正常內(nèi)膜組織作為對(duì)照組，采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)2組NF-κB和HBD-2表達(dá)水平，RT-PCR檢測(cè)NF-κB mRNA和HBD-2 mRNA表達(dá)。結(jié)果 NF-κB在觀察組中的高表達(dá)比例為80.39%明顯高于對(duì)照組的11.90%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HBD-2在觀察組中的高表達(dá)比例為94.12%，明顯高于對(duì)照組的16.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同程度宮腔粘連患者NF-κB和HBD-2高表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組NF-κBmRNA與HBD-2mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(9.56±2.27)和(9.60±2.31)，明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論NF-κB和HBD-2在宮腔粘連內(nèi)膜組織中呈高表達(dá)，兩者可能與宮腔粘連的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

宮腔粘連；NF-κB；HBD-2；內(nèi)膜組織

婦產(chǎn)科各種手術(shù)均可以導(dǎo)致子宮內(nèi)膜的損傷，進(jìn)而促進(jìn)宮腔粘連的發(fā)生，相關(guān)研究表明人工流產(chǎn)術(shù)后、引產(chǎn)以及診斷性刮宮術(shù)后的宮腔粘連的發(fā)生率分別達(dá)1.5%、1.6%、1.9%[1,2]，且由于各種婦產(chǎn)科宮腔操作手術(shù)量的增加，宮腔粘連的發(fā)生率呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)[3]。研究表明，纖維細(xì)胞釋放的纖維蛋白原以及纖維蛋白溶解酶原在調(diào)控子宮內(nèi)膜局部細(xì)胞外基質(zhì)中具有重要的作用，調(diào)節(jié)平衡的喪失可以導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過度堆積，子宮內(nèi)膜逐步被纖維結(jié)締組織取代，最終促進(jìn)了宮腔粘連的發(fā)生[4,5]。核因子NF-κB(nuclear factor κB，NF-κB)和防御素2(βdefensin 2，HBD-2)可以通過激活成纖維細(xì)胞膜上的生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)化受體，促進(jìn)組織型金屬蛋白酶抑制因子的合成和釋放，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂和沉積不良，促進(jìn)宮腔粘連的發(fā)生。本次研究重在通過免疫組化分析NF-κB和HBD-2蛋白水平以及RT-PCR技術(shù)檢測(cè)mRNA的表達(dá)，進(jìn)而評(píng)估二者在宮腔粘連發(fā)生發(fā)展中的作用，從而為宮腔粘連的生物學(xué)治療提供新的選擇。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2016年1月在我院治療的51例宮腔粘連患者的子宮內(nèi)膜作為觀察組，年齡24～35歲，平均年齡(30.32±2.31)歲；同時(shí)選取因繼發(fā)性不孕行宮腔鏡檢查的42例患者的正常內(nèi)膜組織作為對(duì)照組；納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者經(jīng)宮腔鏡檢查證實(shí)；(2)入選前6個(gè)月未使用過任何激素制劑；(3)無子宮內(nèi)膜良惡性及癌前病變、婦科內(nèi)分泌疾病、乳腺腫瘤及乳腺增生；(4)患者知情同意并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有生殖道急性炎癥；(2)子宮內(nèi)膜不典型增生，有宮內(nèi)節(jié)育器及過敏史；(3)有全身結(jié)締組織病變，心、肝、腎等重要臟器疾病。

1.2 檢測(cè)方法 (1)免疫組化檢測(cè)NF-κB和HBD-2的表達(dá)采用石蠟切片脫蠟至水，切片厚度3 mm，3%H2O2室溫孵育5 min，采用去離子水水沖洗3次，每次3 min，采用濃度為10%牛奶蛋白(1 g蛋白加入100 ml純水)封閉，室溫孵育5 min，加入NF-κB和HBD-2抗體(鼠來源，南京碧云天生物科技有限公司),37 ℃孵育2 h，PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，滴加HRP標(biāo)記的二抗(兔來源，購自羅氏檢測(cè)公司)，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，加入 NBT/BCIP色劑顯色5 min，復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡下觀察。OLIPICS電子顯微鏡購自上海精密儀器有限公司，配套試劑購自南京泰康生物科技有限公司。(2)采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè) mRNA的表達(dá)采集患者靜脈血2 ml，按照10 000 r/min的離心速度進(jìn)行離心分離血清，每1毫升的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，加0.2 ml氯仿，劇烈搖動(dòng)30 s，室溫3 min，12 000×g，4℃離心15 min得到RNA。加等體積異丙醇，-20℃，30 min，棄上清，加75%乙醇1 ml，振蕩，20 μl DEPC水，室溫放置5分鐘使其完全溶解。加入逆轉(zhuǎn)錄酶5 μl，室溫下放置20 min后植入37℃水浴鍋中孵育30 min，在底物中加入上游引物0.5 μmol/L、下游引物0.5 μmol/L，RT-PCR反應(yīng)混合液5 μl，dNTP稀釋至 20 μl，反應(yīng)條件：95℃3 min、95℃15 s、90℃5 s，一共40個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物擴(kuò)增長(zhǎng)度為134 bp。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn) 宮腔粘連分度標(biāo)準(zhǔn)采用1988年美國生育協(xié)會(huì)(AFS)制定的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]，對(duì)宮腔粘連面積、病理性質(zhì)及月經(jīng)量進(jìn)行評(píng)分，輕度：1～4分；中度：5～8分；重度：9～12分。

1.4 結(jié)果判斷 以境界清晰的棕黃色或棕褐色顆粒狀沉淀為陽性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取4個(gè)高倍下計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞比例，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例結(jié)果進(jìn)行判斷。陽性細(xì)胞比例評(píng)分：0分為≤10%，1分為11%～25%，2分為26%～50%，3分為>50%；染色強(qiáng)度評(píng)分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。兩者乘積進(jìn)行判斷，0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～6分為陽性(++)，>6分為強(qiáng)陽性(+++)，其中陽性和強(qiáng)陽性為高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 2組NF-κB的表達(dá)NF-κB在觀察組中的高表達(dá)為80.39%。明顯高于對(duì)照組的11.90%，2組NF-κB表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組NF-κB的表達(dá) 例(%)

2.2NF-κB在輕、中、重度宮腔粘連患者中的表達(dá) 不同程度宮腔粘連患者NF-κB高表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 NF-κB在輕、中、重度宮腔粘連患者中的表達(dá) 例(%)

2.3 2組HBD-2在的表達(dá)HBD-2在觀察組中的高表達(dá)比例為94.12%，明顯高于對(duì)照組的16.67%，2組HBD-2表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4HBD-2在輕、中、重度宮腔粘連患者中的表達(dá) 不同程度宮腔粘連患者NF-κB高表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表3 2組HBD-2的表達(dá) 例(%)

表4 HBD-2在輕、中、重度宮腔粘連患者中的表達(dá) 例(%)

2.5NF-κBmRNA與HBD-2mRNA在2組中的表達(dá) 觀察組NF-κBmRNA與HBD-2mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

3 討論

宮腔粘連一般是指宮頸管、宮腔內(nèi)膜部位因?yàn)閷m腔手術(shù)的機(jī)械系損傷或者射線以及感染等因素，導(dǎo)致的子宮腔的相互粘連。近年來對(duì)于宮腔粘連的研究多數(shù)聚焦于其臨床治療方面的效果，包括宮腔鏡聯(lián)合雌孕激素復(fù)合藥物等治療宮腔粘連仍然具有一定的局限性。通過對(duì)于粘連發(fā)生基質(zhì)以及相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)因子方面的探討，能夠?yàn)榻沂菊尺B的發(fā)生機(jī)制以及分子生物學(xué)治療提供新的靶點(diǎn)，改善其臨床治療的效果。成纖維細(xì)胞多數(shù)由于間充質(zhì)細(xì)胞分化而來，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動(dòng)，可以實(shí)現(xiàn)低聚狀態(tài)的纖維成分轉(zhuǎn)化為多聚狀態(tài)的細(xì)胞間質(zhì)成分[7,8]，并可在細(xì)胞損傷、組織修復(fù)等病理過程中通過分泌膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維及有機(jī)基質(zhì)進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定代謝[9,10]。

表5 2組NF-κBmRNA與HBD-2mRNA比較

組別NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)量HBD-2mRNA相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組(n=42)1.04±0.301.01±0.21觀察組(n=51)9.56±2.279.60±2.31t值-24.128-23.995P值<0.05<0.05

任何可以影響到成纖維細(xì)胞生物學(xué)活性或者功能狀態(tài)的因子，都可以促進(jìn)結(jié)締組織的過度增生，促進(jìn)粘連的發(fā)生。NF-κB是高度保守的細(xì)胞因子，在哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞膜上具有不同數(shù)量的NF-κB受體的表達(dá)，NF-κB通過與成纖維細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體結(jié)合，進(jìn)一步上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷、鈣離子等第二信使后，調(diào)控細(xì)胞炎性因子的轉(zhuǎn)錄并影響到成纖維細(xì)胞的活性[7,11]。HBD-2作為天然的抗內(nèi)毒素以及多種微生物的內(nèi)源性多肽，在抗炎過程中發(fā)揮了重要的作用，同時(shí)HBD-2可以影響到MAPK、NF-κB等信號(hào)通路的激活，起到促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路下游效應(yīng)分子的表達(dá)、增強(qiáng)NF-kB激活的生物學(xué)效果，并能夠協(xié)同刺激成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體。相關(guān)研究已證實(shí)，NF-κB以及HBD-2與宮腔粘連具有一定的關(guān)聯(lián)，并與宮腔鏡治療的臨床轉(zhuǎn)歸有關(guān)[12,13]，但對(duì)于二者的免疫組化以及基因水平的探討不足，此為本次研究的創(chuàng)新性所在。

本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB在觀察組中的高表達(dá)比例為80.39%，明顯高于正常對(duì)照宮腔內(nèi)膜組織，其中在宮腔粘連組織中，NF-κB的陽性以及強(qiáng)陽性率占到了主要部位，均超過了20%，而弱陽性比例較低，表明NF-κB在宮腔粘連的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有一定的促進(jìn)作用。NF-κB通過各種途徑以及信號(hào)通路效應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)金屬蛋白類酶原的產(chǎn)生減少，抑制其生理性活動(dòng)能力，從而使得細(xì)胞外基質(zhì)的講解減少、宮腔粘連的發(fā)生率增加。但本次研究中并未發(fā)現(xiàn)NF-κB在不同嚴(yán)重程度的宮腔粘連中的表達(dá)差異，考慮NF-κB主要在粘連的發(fā)生早期起到一定的生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)可能與本次研究的樣本量不足有關(guān)。HBD-2可增強(qiáng)絲氨酸殘基磷酸化效應(yīng)，促進(jìn)NF-κB與NF-κB成纖維細(xì)胞膜上的相關(guān)受體的結(jié)合能力，增強(qiáng)膠原纖維以及疤痕組織的形成能力，HBD-2在觀察組中的高表達(dá)比例為94.12%，明顯高于正常對(duì)照組，且多數(shù)為陽性以及強(qiáng)陽性的表達(dá)，提示HBD-2在宮腔粘連的發(fā)生發(fā)展過程中可能同樣發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

Zhang等[14,15]通過分析宮腔鏡局部切除術(shù)后的宮腔粘連患者的相關(guān)蛋白水平的表達(dá)分析可見，NF-κB在粘連組織中的表達(dá)陽性率可上升4～5倍，其機(jī)制可能與促進(jìn)成纖維細(xì)胞表面的金屬蛋白酶轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子受體有關(guān)，同時(shí)NF-κB的陽性率與宮腔鏡治療后的粘連復(fù)發(fā)率具有一定的關(guān)聯(lián)。對(duì)于mRNA轉(zhuǎn)錄水平的研究可見，觀察組NF-BmRNA與HBD-2mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯上升，提示在基因轉(zhuǎn)錄水平即可發(fā)生NF-κB以及HBD-2的表達(dá)的差異，NF-κB以及HBD-2轉(zhuǎn)錄上游的啟動(dòng)子以及增強(qiáng)子的激活，可以促進(jìn)NF-κB以及HBD-2蛋白水平的表達(dá)，但具體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制仍然需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，NF-κB和HBD-2在宮腔粘連內(nèi)膜組織中呈高表達(dá)，同時(shí)在mRNA水平也可見二者的異常表達(dá)，NF-κB和HBD-2在宮腔粘連的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，但具體的機(jī)制研究仍然有待后續(xù)大規(guī)模、多種心的對(duì)照研究。

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Expression of NF-κB and HBD-2 in endometrium of patients with intrauterine adhesion

YAOYali,DENGMandan,LIYi.

DepartmentofGynaecologyandObstetrics,TheFirstHospitalofChangshaCity,Changsha410005,China

Objective To investigate the correlation between the expressions of nuclear factor B (NF-κB),βdefensin 2 (HBD-2) and intrauterine adhesion.Methods Fifty-one patients with intrauterine adhesion who were treated in our hospital from January 2015 to January 2016 were served as observation group,at the same time,42 healthy subjects with normal endometrial tissues were served as control group.The expression levels of NF-κB mRNA and HBD-2 mRNA were detected by RT-PCR.Results The high-expression proportion of NF-κB in observation group was 80.39%,which was significantly higher than that (11.90%) in control group (P<0.05),moreover,thehigh-expressionproportionofHBD-2inobservationgroupwas94.12%,whichwassignificantlyhigherthanthat(16.67%)incontrolgroup(P<0.05).Howevertherewasnosignificantdifferenceinthehigh-expressionproportionofNF-κBandHBD-2inpatientswithintrauterineadhesionatdifferentdegrees(P<0.05) 5).TherelativeexpressionlevelsofNF-κBmRNAandHBD-2mRNAinobservationgroupwere9.56±2.27and9.60±2.31,respectively,whichweresignificantlyhigherthanthoseincontrolgroup(P<0.05).Conclusion The high-expressions of NF-κB and HBD-2 exist in endometrium of patients with intrauterine adhesion,and both factors may be correlated to the pathogenesis and development of intrauterine adhesion.

intrauterine adhesions; NF-κB;HBD-2;endometrial tissues

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.06.009

410005 湖南省長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科

R

A

1002-7386(2017)06-0837-04

2016-09-18)