Notch1及P16在軟骨肉瘤中的表達及臨床意義

王克猛 魏世平

·論著·

Notch1及P16在軟骨肉瘤中的表達及臨床意義

王克猛 魏世平

目的 觀察軟骨肉瘤中Notch1蛋白及P16蛋白的表達情況，探討其在軟骨肉瘤發生發展中的作用機制。方法 選取軟骨肉瘤46例，骨軟骨瘤18例及正常骨組織10例。以SP法檢測組織中Notch1及P16蛋白表達的情況。結果 Notch蛋白陽性表達為細胞膜和細胞漿內有棕黃色顆粒。在骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中Notch1的陽性表達率明顯高于正常軟骨組織(P<0.05)，軟骨肉瘤中Notch1的陽性表達率明顯高于骨軟骨瘤(P<0.05)。Notch1蛋白在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 不同組織學分級的軟骨肉瘤中的陽性表達率隨分化程度降低逐漸增高(P<0.05)。P16蛋白陽性表達為細胞核或/和細胞漿內有棕黃色顆粒出現。P16蛋白在正常軟骨組織及骨軟骨瘤中的均為陽性表達，在軟骨肉瘤中陽性表達率為39.1%(18/46)。軟骨肉瘤組織中P16蛋白陽性表達率明顯低于其他兩種組織(P<0.05)。不同組織學分級軟骨肉瘤中P16蛋白的陽性表達率分別為68.8%(11/16)、30%(6/20)和20%(1/10)，陽性表達率隨分化程度越低而降低(P<0.05)。Notch1及P16蛋白的表達情況與患者的性別、年齡、體積大小及腫瘤發生部位均無統計學意義(P>0.05)。結論Notch1蛋白高表達、P16蛋白低表達可能協同促進軟骨肉瘤的惡性細胞的增殖能力，在腫瘤的發生及發展起著重要的作用，為進一步的研究和臨床治療提供病理學依據。

Notch1蛋白；P16蛋白；軟骨肉瘤；免疫組織化學

軟骨肉瘤(chondrosarcoma，CHS)是一類起源于間質細胞具有多分化潛能的惡性骨腫瘤，起源于軟骨組織的惡性腫瘤，以產生軟骨基質為特征[1,2]。Evans等[3]根據軟骨肉瘤的惡性程度將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級三類，即惡性程度為低、中、高。軟骨肉瘤細胞對放療、化療等手段都不太敏感，在手術切除后非常復發和轉移，預后較差[4]。本研究通過免疫組織化學SP 法研究Notch及P16蛋白在軟骨肉瘤中表達情況，探討其臨床意義，以期為軟骨肉瘤的分子靶向治療提供新的標記物，改善患者預后。軟骨肉瘤的分子靶向治療具有特異性高、損傷小、毒副作用小的特點，已成為繼手術、放療和化療之后的新的治療手段。因此，尋找可用于治療軟骨肉瘤的靶點對于軟骨肉瘤的治療具有十分重要的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取邢臺醫專第一附屬醫院病理科2008年3月至2014年3月期間手術切除經病理明確診斷為軟骨肉瘤的存檔病例，復習原切片及免疫組織化學資料，根據2002年WHO軟組織與骨腫瘤病理學和遺傳學分類標準[5]，經兩位資深骨病理醫師閱片確定，篩選出普通型軟骨肉瘤46例，其中男25例，女21例；患者年齡5～83歲，中位年齡43.7歲；發生部位：股骨27例，髖骨(髂骨、恥骨、坐骨)11例，其他部位8例；組織學分級Ⅰ級16例、Ⅱ級20例、Ⅲ級10例；所有患者為散發病例，且為初次手術，術前均未經放射治療或化療。另外選取骨軟骨瘤18例及正常軟骨組織10例作為對照。

1.2 方法 所有標本經10%中性緩沖甲醛固定，常規取材、脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片，連續切片，貼于涂有APES的載玻片，用SP法進行免疫組織化學法染色。兔抗人Notch1多克隆抗體試劑盒、鼠抗人P16單克隆抗體試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術公司，免疫組化染色按試劑盒操作說明進行，染色過程中設陽性和陰性對照，陽性對照用已知陽性切片，陰性對照采用PBS代替一抗。

1.3 免疫組化染色結果判斷標準 (1)Notch1蛋白陽性表達主要定位于細胞膜和細胞漿上，表現為細胞膜和細胞漿內有棕黃色顆粒出現。顯微鏡下盲法閱片，400×高倍鏡下隨機觀察10個視野(向同一方向移動切片，不重復，不重疊)，每個視野計數100個腫瘤細胞中的陽性細胞數。免疫組織化學染色結果按照文獻采用以下判斷標準。以各視野中陽性細胞的平均百分數進行計分。0～5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。(2)染色強度以多數陽性細胞呈現的染色特征為標準計分。細胞未著色為0分，染色呈淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最后以陽性細胞的百分比和染色強度計分之和所得總分進行結果判定。0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)， 4～5分以上為強陽性(++)[6]。(3)P16蛋白免疫組織化學染色陽性反應為棕黃色和(或)棕褐色顆粒，陽性表達定位于細胞核或(和)細胞漿上，400×高倍鏡下隨機觀察10個視野(向同一方向移動切片，不重復，不重疊)，每個視野計數100個腫瘤細胞中的陽性細胞數，觀察陽性細胞與細胞總數的比例關系。無陽性細胞為陰性(-)；表達≤50%為陽性(+)；>51%為強陽性(++)[7]。

1.4 統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件,計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1Notch1蛋白免疫組化表達情況Notch蛋白陽性表達特征為細胞膜和細胞漿內有棕黃色顆粒。在骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中Notch1的陽性表達率明顯高于正常軟骨組織(P<0.05)，軟骨肉瘤中Notch1的陽性表達率明顯高于骨軟骨瘤(P<0.05)。Notch1蛋白在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 不同組織學分級的軟骨肉瘤中的陽性表達率隨分化程度降低逐漸增高(P<0.05)。見圖1，表1、2。

圖1 Notch1在骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中的表達HE (IHC×400)

表1 Notch1在正常軟骨組織、骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中的表達 例

注：與正常軟骨組織比較,*P<0.05；與骨軟骨瘤比較，#P<0.05

表2 Notch1在不同分化程度的軟骨肉瘤中的表達 例

注：與Ⅰ級比較，*P<0.05；與Ⅱ級比較，#P<0.05

2.2P16蛋白免疫組化表達情況P16蛋白陽性表達為細胞核或(和)細胞漿內有棕黃色顆粒出現。本實驗中P16蛋白在正常軟骨組織及骨軟骨瘤中的均為陽性表達情，在軟骨肉瘤中陽性表達率為39.1%(18/46)。軟骨肉瘤組織中P16蛋白陽性表達率明顯低于其他兩種組織(P<0.05)。不同組織學分級軟骨肉瘤中P16蛋白的陽性表達率分別為68.8%(11/16)、30%(6/20)和20%(1/10)，陽性表達率隨分化程度越低而降低(P<0.05)。見圖2，表3、4。

2.3Notch1及P16蛋白與軟骨肉瘤主要臨床病理資料間的關系Notch1及P16蛋白的表達情況與患者的性別、年齡、體積大小及腫瘤發生部位均無統計學意義(P>0.05)。見表5。

3 討論

Notch信號是一個進化中高度保守的跨膜受體信號通路家族，其所編碼的單鏈跨膜受體蛋白，其所編碼的單鏈跨膜受體蛋白在細胞的分化、個體發育的中起著關鍵作用，從無脊椎動物到脊椎動物等多種物種的細胞中均有表達，廣泛分布和表達在多種組織中。其家族成員重要作用之一是調控細胞的發育和凋亡，以及調節胚胎發育、成人器官的干細胞，也可以被惡性腫瘤激活[8]。目前，在脊椎動物中發現了Notch1、Notch2、Notch3和Notch4同源體，其中Notch1蛋白是主要的受體[9]。Notch1信號通路主要作用于細胞的分化發育、增殖凋亡等，而且某些腫瘤的發生和發展也與Notch1信號通路密切相關。

圖2 P16在骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中的表達HE (IHC×400)

表3 P16在正常軟骨組織、骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中的表達 例

注：與軟骨肉瘤比較,*P<0.05

表4 P16在不同分化程度的軟骨肉瘤中的表達 例

注：與Ⅰ級比較，*P<0.05；與Ⅱ級比較，#P<0.05

表5 CDK4、P16的表達與臨床病理特征的關系 例

Notch1信號蛋白編碼一種膜蛋白受體，通過誘導細胞凋亡、增殖和分化多效性作用的信號途徑調節多細胞動物的形態發育和形成。“三步蛋白質水解模式”是Notch信號傳導通路中重要的分子事件，當其配體與受體結合后誘導受體蛋白水解，Notch蛋白從膜上釋放的活化形式為NICD，NICD進入核內后，其RAM區以及CSL蛋白、MAml蛋白結合后形成轉錄復合物，與下游su(H)/CBF1家族轉錄因子結合，激活相關轉錄因子，上調它們的活性，在細胞分化的起始過程中發揮著精確調控作用。

P16基因定位于9p21，是一種抑癌基因，定位于9p21。P16的轉錄產物由外顯子1a、2、和3構成，編碼P16(INK4A)蛋白，它與P15(INK4B)、P18(INK4C)及P19(ARF)共同組成INK4(細胞周期依賴性激酶抑制劑)家族，在正常細胞生長調控中起著至關重要的作用，與細胞分化及預后有關。P16作為細胞周期素依賴性激酶抑制劑，它在細胞周期的許多調節環節處起到一個閘的作用，P16蛋白與CyclinD競爭性特異性結合細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4及其相關激酶CDK6相互作用，抑制Rb磷酸化，在Gl期(DNA合成前期)阻止細胞分裂，從而抑制細胞周期從G1進入S期，對細胞增殖周期起負性調節作用[10]。當P16基因出現異常改變、缺失或突變以及功能喪失時，它可抑制CyclinD-CDK4的活性，使細胞周期加速，DNA在還沒修復前就迅速從G1期進入S、G2、M期，細胞過度增殖從而導致細胞失控性生長和腫瘤的形成[11]。

Notch1蛋白可以使許多實體瘤及血液系統腫瘤異常表達，促使正常細胞向惡性轉化，已經在很多實驗證實。在乳腺癌中低分化、分期晚、淋巴結轉移以及腦轉移相關[12]都與Notch1蛋白的高表達密切相關。Notch蛋白信號通路過表達可能參與胃黏膜的癌變過程[13]，Notch1蛋白在胃癌中表達明顯高于正常胃組織，李大衛等[14]研究發現，Notch1蛋白的高表達并與腫瘤的大小、分化程度、浸潤深度、脈管浸潤程度密切相關。在食管癌、舌癌、結直腸癌、宮頸癌和非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤細胞中Notch1蛋白都呈高表達[15-17]。Notch1蛋白并不是一個獨立的預后因素，其作用與腫瘤及其他信號通路的影響有密切聯系[18]，在不同的腫瘤微環境中，可能會促進或抑制腫瘤發生發展。非浸潤性膀胱癌中的患者的預后不良與Notch1的低表達密切相關[19]。在食管鱗癌中則可能是一種抑癌基因[20]。在食管癌、胃腸癌、肺癌、妊娠滋養細胞瘤、鼻咽癌、神經膠質細胞瘤等多種惡性腫瘤中P16基因異常表達，P16蛋白的失活，與惡性腫瘤細胞的發生發展中起重要作用[21-25]。

該研究結果顯示，Notch1蛋白的陽性表達率在軟骨肉瘤、骨軟骨瘤及正常軟骨組織3組間逐漸增高，組間差異性有統計學意義(P<0.05)。軟骨肉瘤中Notch1蛋白陽性表達與病理組織學分級密切相關，軟骨肉瘤分級的升高，Notch1的陽性表達率越高，提示其增高可能促進軟骨肉瘤的惡性增殖能力提高。P16蛋白在本實驗正常軟骨組織及骨軟骨瘤標本均是陽性表達，而在軟骨肉瘤中的陽性表達率為39.1%，且分化程度越低P16蛋白陽性表達率也隨之降低(P<0.05)。提示P16蛋白失活、Notch1過表達與軟骨肉瘤的發生有密切關聯，使細胞獲得無限增殖能力，向惡變發展，為軟骨肉瘤進一步的研究和臨床治療提供病理學依據。

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Expression and clinical significance of Notch1 and P16 in chondrosarcoma

WANGKemeng*,WEIShiping.

*DepartmentofOrthopedics,TheFirstAffiliatedHospitalofXingtaiMedicalCollege,Hebei,Xingtai054000,China

Objective To observe the expressions of Notch1 protein and P16 protein in chondrosarcoma in order to explore their action mechanism in the pathogenesis and and development of chondrosarcoma.Methods The expression levels of Notch1 protein and P16 protein were detected by immunohistochemistry (SP) in 46 cases of chondrosarcoma,18 cases of osteochondroma and 10 cases of normal cartilage tissues.Results The positive expression rate of Notch1 protein in osteochondroma and chondrosarcoma was significantly higher than that in normal cartilage tissues (P<0.05),moreover,thepositiveexpressionratesofNotch1proteininchondrosarcomawassignificantlyhigherthanthatinosteochondroma(P<0.05).ThepositiveexpressionrateofNotch1proteinwasgraduallyincreasedindifferenthistologicalgradesofchondrosarcoma(gradeⅠ,gradeⅡ,gradeⅢ),withthedecreaseofdifferentiationdegree(P<0.05).ThepositiveexpressionsofP16proteinwereobservedinnormalcartilagetissuesandinosteochondromatissues.ThepositiveexpressionrateofP16proteininchondrosarcomawas39.1% (18/46),whichwassignificantlylowerthanthatinosteochondromatissuesandinnormalcartilagetissues(P<0.05).ThepositiveexpressionrateofP16proteinindifferenthistologicalgradesofchondrosarcoma(gradeⅠ,gradeⅡ,gradeⅢ)was68.8% (11/16),30% (6/20),20% (1/10),respectively,whichwasgraduallydecreasedwiththedecreaseofdifferentiationdegree(P<0.05).TheexpressionsofNotch1proteinandP16proteinwerenotcorrelatedtopatient’sage,sex,tumorsize,tumorposition(P>0.05). Conclusion The high-expression of Notch1 protein and low-expression of P16 protein may synergistically promote the proliferation ability of chondrosarcomatous malignant cells,which may play an important role in the pathogenesis and development of chondrosarcoma,and the research results provide pathological basis for clinical treatment and further research.

Notch1 protein; P16 protein; chondrosarcoma; immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.06.005

054000 河北省邢臺市，邢臺醫學高等專科學校第一附屬醫院骨科(王克猛)；邢臺醫學高等專科學校(魏世平)

魏世平,054000 河北省邢臺市，邢臺醫學高等專科學校；

E-mail:weishiping2003@163.com

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A

1002-7386(2017)06-0822-04

2016-10-11)