TGF-β1、LMO1在胃癌組織中的表達及意義

孫云 胡曉杰 馬國娟 尹香云 馮博超 彭彥輝

·論著·

TGF-β1、LMO1在胃癌組織中的表達及意義

孫云 胡曉杰 馬國娟 尹香云 馮博超 彭彥輝

目的 觀察轉化生長因子β1(TGF-β1)、LMO1在胃癌組織的表達及二者的相關性，探討TGF-β1、LMO1在胃癌發生發展中的作用。方法 選取60例胃癌和50例正常胃組織，采用Real time-PCR和Western Blot檢測TGF-β1、LMO1 mRNA和蛋白表達水平。采用免疫組織化學SP法檢測TGF-β1、LMO1蛋白表達，分析TGF-β1、LMO1表達與胃癌臨床病理特征的關系。結果 胃癌組織TGF-β1、LMO1 基因的mRNA和蛋白表達水平均比正常胃黏膜組織明顯增強(P<0.05)。TGF-β1、LMO1蛋白在胃癌組織中陽性表達率明顯高于正常胃黏膜組織(P<0.05)。TGF-β1、LMO1表達與年齡、性別、發病部位無關(P>0.05)，而與腫瘤浸潤深度、分化程度、TNM臨床分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)。TGF-β1、LMO1表達呈正相關(r=0.875，P=0.001)。結論 胃癌組織TGF-β1、LMO1表達異常增高，可能參與了胃癌發生發展。TGF-β1、LMO1可作為反映胃癌惡性生物學行為及治療的分子指標之一。

胃癌；TGF-β1；LMO1；臨床意義

胃癌是來源于胃黏膜上皮的消化道惡性腫瘤，其發病率和病死率極高，居惡性腫瘤死亡第二位[1]。目前，胃癌發病機制尚未完全闡明，研究顯示多個基因與調控因子參與了胃癌等實體瘤的發生發展，這些基因。轉化生長因子β1基因(transforming growth factor beta-1，TGF-β1)與惡性腫瘤關系密切，具有原癌基因的特性，該基因在惡性腫瘤的進展中，在參與惡性腫瘤細胞異常分化、促進細胞增殖和增強腫瘤細胞凋亡抵抗等過程中發揮了重要作用。研究表明，TGF-β1異常表達與胰腺癌、結直腸癌等消化道惡性腫瘤發生[2,3]。單純LIM結構域(LIM domain only，LMO)是一類富含半胱氨酸且僅由一個或多個LIM結構域串聯組成的蛋白質家族，LMO家族成員的蛋白質分子中均含有特征性的LIM結構域[4]。LMO家族目前已發現4個成員，分別為LMO1、LMO2、LMO3和LMO4，其中LMO1是LMO蛋白家族的主要成員之一。LMO1作為細胞核內的輔助轉錄因子，其LIM 結構域可作為蛋白質相互作用的適配器，通過與其他蛋白相互作用形成復合體，調控基因轉錄活性，參與細胞分化、增殖等生物學過程[5]。然而，TGF-β1、LMO1在胃癌組織的表達關系及意義目前還沒有統一意見。本研究以多種方法檢測了胃癌組織TGF-β1、LMO1mRNA和蛋白的表達情況，分析了TGF-β1、LMO1蛋白與胃癌患者臨床病理特征的關系，探討了TGF-β1、LMO1蛋白之間的關系及臨床意義，為胃癌發病機制及綜合診療提供了依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入組患者為2013年4月至2014年4月于我院確診為胃癌并行手術切除者，患者共60例。所有患者均為初診患者，術前未接受過放化療、靶向治療或生物治療。所有患者均有完整的病歷資料。患者中男38例，女22例;年齡32～62歲，中位年齡48.4歲;胃癌發生部位：賁門15例，胃體20例，胃竇25例；WHO分型：低分化腺癌34例，中分化腺癌18例，高分化腺癌8例；TNM臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期20例，Ⅲ+Ⅳ期40例；浸潤深度超過漿膜層41例，未超過漿膜層19例；局部淋巴結轉移陽性者48例，淋巴結轉移陰性者12例。選取同期于我院行胃鏡活檢病理證實為正常胃黏膜的標本50例作為對照組,其中男28例，女22例；年齡21～63歲，中位年齡44.8歲。

1.2 主要試劑 兔抗人TGF-β1、LMO1多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產品。Trizol、實時熒光定量試劑盒購自美國Promega公司。免疫組化試劑盒購自上海生工生物公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Real time-PCR檢測TGF-β1、LMO1基因mRNA的表達:TGF-β1、LMO1基因的引物均由上海生工生物公司設計并合成。GAPDH為內參照基因。將胃癌及正常胃黏膜組織標本各100 mg于液氮中研磨，一步法Trizol提取組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度。采用ABI 7300型熒光定量PCR儀進行Real time-PCR實驗。實驗結束后采用儀器自帶的SDS v1. 3軟件分析得出各樣本的Ct值。將對照組樣品Ct值設定為標準1，TGF-β1、LMO1基因表達水平的相對定量值為RQ=2-ΔΔCt，將RQ值用于統計分析，計算TGF-β1、LMO1基因的相對表達量。見表1。

表1 TGF-β1、LMO1、GAPDH引物序列

1.3.2 Western-blot技術檢測TGF-β1、LMO1基因蛋白的表達:取新鮮胃癌和正常胃組織標本100 mg，加入裂解液100 μl，冰上靜置30 min，4℃ 12 000 g離心30 min，BCA法進行蛋白定量。將50 μg總蛋白進行10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉移至PVDF膜上，10%脫脂奶粉封閉2 h，加入特異性抗TGF-β1、LMO1抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，TBST清洗，ECL化學發光法顯色、定影。將目的蛋白吸光度值與內參照蛋白的比值作為目的蛋白的相對表達強度。

1.3.3 免疫組織化學SP法檢測TGF-β1、LMO1基因蛋白的表達:采用免疫組織化學SP法檢測TGF-β1、LMO1蛋白表達，操作嚴格按照試劑盒說明進行。具體步驟如下：組織標本中性甲醛固定、包蠟，連續切片，厚度為4 μm，脫蠟至水，PBS漂洗3次，5 min/次，抗原修復后再以PBS漂洗，山羊血清工作液室溫封閉15 min，分別滴加TGF-β1、LMO1一抗，4℃過夜，PBS漂洗，滴加二抗，37℃孵育 30 min，滴加辣根酶標記的羊抗鼠IgG，37℃孵育5 min，DAB 顯色，蘇木精復染后中性樹膠封片，鏡下讀片并對結果進行判斷。TGF-β1定位于細胞漿或細胞核，LMO1定位于細胞核。TGF-β1、LMO1均以出現黃色、棕色或棕褐色顆粒為陽性。具體判定標準為：每張切片由兩名病理醫師盲法測定。隨機選取5個200倍的鏡下視野，每個視野隨機計數100個細胞，當陽性細胞數所占比例≥20%為陽性，<20%計為陰性。

2 結果

2.1 胃癌和正常胃黏膜組織TGF-β1、LMO1mRNA相對表達水平Realtime-PCR結果顯示，在胃癌和正常胃組織中，TGF-β1mRNA表達水平分別為(5.33±0.75)、(1.29±0.18)，LMO1mRNA表達水平分別為(5.07±0.78)、(1.12±0.15)，TGF-β1、LMO1mRNA在胃癌組織的相對表達水平明顯高于正常胃黏膜組織(P<0.05)。見表2。

類別TGF-β1mRNA相對表達水平LMO1mRNA相對表達水平胃癌組織(n=60) 5.33±0.75*5.07±0.78*正常胃組織(n=50)1.29±0.181.12±0.15

注：與正常胃組織比較,*P<0.05

2.2 胃癌和正常胃黏膜組織TGF-β1、LMO蛋白相對表達水平Western-blot結果顯示，在胃癌和正常胃黏膜組織中，TGF-β1蛋白表達水平分別為(4.56±0.62)、(1.12±0.15)，LMO1蛋白表達水平分別為(4.31±0.58)、(0.93±0.15)，TGF-β1、LMO1蛋白在胃癌組織的表達水平明顯高于正常胃黏膜組織(P<0.05)。見表3。

類別TGF-β1蛋白相對表達水平LMO1蛋白相對表達水平胃癌組織(n=60)4.56±0.62*4.31±0.5*正常胃組織(n=50)1.12±0.150.93±0.15

注：與正常胃組織比較,*P<0.05

2.3 胃癌和正常胃黏膜組織TGF-β1、LMO1蛋白陽性表達情況 免疫組化(SP)結果顯示，TGF-β1蛋白主要定位于細胞的胞漿或胞膜，LMO1蛋白主要定位于胞核中，以出現黃色、棕色或棕褐色顆粒為陽性。胃癌組織TGF-β1、LMO1蛋白陽性表達率分別為85.0%(51/60)、83.33%(50/60)，正常胃組織TGF-β1、LMO1蛋白陽性表達率分別為12.0%(6/50)、8.0%(4/50)，胃癌組織TGF-β1、LMO1蛋白陽性表達率顯著高于正常胃黏膜組織(P<0.05)。見表4,圖1。

表4 胃癌和正常胃組織TGF-β1、LMO1蛋白陽性表達情況

注：與正常胃組織比較,*P<0.05

圖1 胃癌組織中LMO1、TGF-β1蛋白陽性表達情況(SP×200)

A胃癌組織中LMO1蛋白表達；B胃癌組織中TGF-β1蛋白表達

2.4 胃癌組織TGF-β1、LMO1蛋白表達與臨床病理特征的關系TGF-β1、LMO1蛋白在胃癌組織的表達與患者年齡、性別、胃癌發生部位無明顯關系(P>0.05)，而與胃癌組織分級、TNM臨床分期、腫瘤浸潤深度、區域淋巴結轉移等特征有關(均P<0.05)。見表5。

表5 TGF-β1、LMO1蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.5 胃癌組織TGF-β1、LMO1蛋白表達的相關性 60例胃癌組織中，TGF-β1、LMO1均陽性表達者46例(76.67%)，TGF-β1陽性表達且LMO1陰性表達者5例(8.33%)，TGF-β1陰性表達且LMO1陽性表達者3例(5.0%)。相關分析顯示，TGF-β1、LMO1表達呈明顯正相關(r=0.875，P=0.001)。見表6。

3 討論

胃癌進展迅速，易于發生浸潤轉移。多基因、多步驟參與這一過程，這些基因的共同作用導致胃癌進展。

表6 TGF-β1、LMO1蛋白在胃癌組織表達的相關性 例

原癌基因激活、抑癌基因失活及其介導的信號轉導通路異常貫穿于癌細胞生長、擴散及轉移的全過程。胃癌由于具有進展迅速、早期轉移等特點，患者在醫院就診時往往已處于進展期，治療效果不理想，預后差。因此，探討胃癌發病機制對胃癌綜合診治意義重大。但該領域迄今尚無突破性進展。TGF-β1是淋巴細胞、單核細胞分泌的具有多種生物學活性的多肽類細胞因子，在細胞增殖、分化、血管生成、組織損傷修復、細胞外基質形成、胚胎發育等生理過程中發揮重要調控作用[6-8]。近年來多項研究表明，TGF-β1在多種惡性腫瘤組織過度表達，與腫瘤發生、發展及預后密切相關[9-12]。在腫瘤發生、發展早期，TGF-β1對腫瘤生長發揮抑制作用。然而，在腫瘤發展進展期TGF-β1能夠促進腫瘤細胞與細胞外基質相互作用及腫瘤新生血管形成，同時發揮免疫抑制作用，從而促進腫瘤生長、浸潤和轉移[13]。LMO1是僅含一個或多個LIM結構域的LMO蛋白家族成員，可通過與轉錄因子或其他蛋白相互作用形成轉錄復合物調控靶基因轉錄，在調控細胞生長、分化過程中發揮關鍵作用。Matthews等[14]研究發現LMO蛋白家族成員(LMO1～LMO4)均與腫瘤發生、發展密切相關。Wang等[15]報道發現，在腫瘤細胞中過表達LMO1基因能夠明顯增強腫瘤細胞的增殖能力，導致腫瘤進展；反之抑制LMO1基因則能夠明顯使腫瘤生長減慢。因此，調控胃癌中LOM1表達可能對胃癌的進展過程產生影響。

為了解TGF-β1、LMO1基因在胃癌中的表達及作用，本研究采用Realtime-PCR、Western-blot和免疫組化法等多種分子生物學技術檢測了胃癌組織及正常胃黏膜組織TGF-β1、LMO1mRNA和蛋白表達情況。結果顯示，TGF-β1、LMO1在胃癌組織中表達顯著高于正常胃組織，提示TGF-β1、LMO1基因可能在胃癌發生中發揮了重要作用，促進了胃癌的發生和進展。結合TGF-β1、LMO1表達與胃癌臨床病理特征的關系，我們發現TGF-β1、LMO1表達與患者年齡、性別、胃癌發生部位無關，而與腫瘤浸潤深度、組織分級、TNM臨床分期、淋巴結轉移有關，說明TGF-β1、LMO1在胃癌進展中也發揮了重要作用[10,11]。本結果與報道TGF-β1、LMO1在惡性腫瘤高表達的研究結果相符合。相關性分析顯示，胃癌組織TGF-β1、LMO1蛋白表達趨勢一致，提示TGF-β1、LMO1蛋白可能共同作用在胃癌發生、發展及浸潤轉移中發揮協同作用，促進了胃癌的進展及侵襲轉移。Saeki等[16]研究發現，胃上皮細胞TGF-β1通過上調LMO1、GSDM表達參與調控細胞凋亡過程，說明TGF-β1、LMO1具有正相關性。因此，我們推測胃癌組織TGF-β1、LMO1表達可能存在相互促進作用，LMO1可能參與TGF-β1對腫瘤細胞增殖、分化及擴散轉移的調控，但確切機制尚待進一步研究。

本研究結果顯示，TGF-β1、LMO1在胃癌組織高表達，且二者陽性表達與胃癌浸潤深度、組織分級、TNM臨床分期及淋巴結轉移密切相關。另外，TGF-β1、LMO1表達具有正相關性，提示胃癌組織在TGF-β1、LMO1高表達基礎上，TGF-β1表達可能通過上調LMO1表達促進腫瘤細胞的增殖、分化及浸潤轉移。總之，TGF-β1、LMO1在胃癌組織的高表達與胃癌的惡性生物學行為有關，聯合檢測胃癌組織TGF-β1、LMO1表達情況有可能準確反映患者的病情。進一步研究中我們準備擴大樣本量并進行體外及體內研究，深入發掘TGF-β1、LMO1基因參與胃癌進展的機制，為尋找新的腫瘤標志物、確定腫瘤治療靶基因提供有益的思路。

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Expression and clinical significance of TGF-β1 and LMO1 in gastric cancer tissues

SUNYun*,HUXiaojie*,MAGuojuan,etal.

*TheFourthDepartmentofGeneralSurgery,HebeiProvincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

Objective To observe the expression of transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) and LMO1 in gastric cancer tissues,and to explore their roles in the pathogenesis and development of gastric cancer．Methods The expression levels of TGF-β1 and LMO1 mRNA and protein in 60 cases of gastric carcinoma tissues and 50 cases of normal gastric mucosa tissues were detected by Real time-PCR and Western Blot,moreover, the expression levels of TGF-β1 and LMO1 protein were detected by immunohistochemistry (SP).Besides the correlation between expressions of TGF-β1,LMO1 and clinical pathological characteristics was analyzed.Results The expression levels of TGF-β1 and LMO1 mRNA in gastric carcinoma tissues were significantly higher than those in normal gastric mucosa tissues (P<0.05).MoreoverthepositiveexpressionratesofTGF-β1andLMO1proteinsingastriccancertissueswere85.0% (51/60),83.33% (50/60),respectively,whichweresignificantlyhigherthanthoseinnormalgastricmucosatissues[12.0% (6/50), 8.0% (4/50),respectively,P<0.05].TheexpressionsofTGF-β1andLMO1werenotcorrelatedtopatient'sage,sex,tumorposition(P>0.05),however,whichwerecorrelatedwithinfiltrationdepthoftumor,differentiationdegreeoftumor,TNMstagingandlymphnodemetastasis(P<0.05).MoreovertheexpressionofTGF-β1waspositivelycorrelatedtothatofLMO1ingastriccarcinoma(r=0.875,P<0.01).Conclusion The overexpressions of TGF-β1 and LMO1 exist in gastric carcinoma tissues,which may play some roles in the pathogenesis and development of gastric cancer. Therefor TGF-β1 and LMO1 can be regarded as one of molecule indexes to evaluate the malignant biological behavior of gastric cancer and may become potential targets for the treatment of gastric cancer．

gastric cancer; TGF-β1; LMO1; clinical significance

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.06.004

050051 石家莊市，河北省人民醫院普外四科(孫云、胡曉杰、尹香云、馮博超)，門診部(馬國娟)，普外三科(彭彥輝)

彭彥輝，050051 石家莊市，河北省人民醫院普外三科；

R

A

1002-7386(2017)06-0818-04

2016-10-10)

E-mial:puwaisanke@126.com