Ⅱ、Ⅲ期結腸癌患者TS、TP和DPD表達水平與5-Fu為基礎的化療療效及預后的關系研究

晉國權 李淼

·論著·

Ⅱ、Ⅲ期結腸癌患者TS、TP和DPD表達水平與5-Fu為基礎的化療療效及預后的關系研究

晉國權 李淼

目的 分析探討Ⅱ、Ⅲ期結腸癌患者TS、TP、DPD表達水平與5-Fu為基礎的化療療效及預后的相關性。方法 入選120例術后接受氟尿嘧啶為基礎化療的Ⅱ、Ⅲ期結腸癌患者，采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)分析TS、TP、DPD表達水平與化療療效及患者生存預后的相關性。結果 腫瘤組織的TP mRNA表達水平明顯高于正常組織，DPD mRNA表達水平明顯低于正常組織(P<0.01)。經相關性分析，TS與TP、DPD與TP的mRNA相對表達量之間具有弱正相關關系(r2=0.04937,P=0.0096;r2=0.08345,P=0.0007)。TS、TPmRNA的高表達更傾向于對5-Fu化療藥物不敏感，無瘤生存率和總生存率均偏低(P<0.01)；多元COX回歸分析結果提示：除了腫瘤分化、腫瘤細胞轉移等傳統危險因素外，TS、TPmRNA表達也是影響結腸癌總生存率的獨立危險因素(OR=2.036,95%CI:1.896～3.656;OR=2.426,95%CI:2.037～2.945)。結論 Ⅱ、Ⅲ期結腸癌患者TS、TP高表達更傾向于對5-Fu化療藥物不敏感且生存預后較差，TS、TP表達情況對臨床上制定個體化的化療方案具有一定的指導價值。

結腸腫瘤；胸苷酸合成酶；胸苷磷酸化酶；二氫嘧啶脫氫酶

近年來，以氟尿嘧啶(5-Fu)為基礎的術后輔助化療方案越來越多的用于惡性腫瘤的輔助化療。胸苷酸合成酶(TS)、胸苷磷酸化酶(TP)和二氫嘧啶脫氫酶(DPD)是5-Fu代謝和作用途徑中的關鍵酶[1-4]。為了進一步評估上述關鍵酶在預測Ⅱ、Ⅲ期結腸癌患者接受以5-Fu為基礎的輔助化療方案后治療效果及生存預后中的臨床價值，本研究采用前瞻性觀察設計方案，分析探討Ⅱ、Ⅲ期結腸癌患者TS、TP、DPD mRNA的表達規律，旨在為結腸癌的個體化治療方案的制定提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年1月至2009年1月在我院腫瘤科住院治療的結腸癌患者120例為研究對象。另外，收集同期在我院普外科由于結腸癌之外的疾病而手術切除的正常結腸組織15例為對照。見表1。

表1 120例結腸癌的基本特征及主要臨床病理參數

1.2 入選標準 (1)組織病理學檢查結果確診為Ⅱ、Ⅲ期結腸癌；(2)入選患者接受氟尿嘧啶類藥物(5-Fu)為基礎的輔助化療方案；(3)臨床病歷資料記錄詳實，且理論上能夠完成療效評估及5年隨訪；(4)知情同意以后，患者及家屬同意參加本研究，并簽署知情同意書。本研究獲得本院醫學倫理委員會的審核批準。

1.3 信息采集 采用本研究自制的統一調查表，收集患者的基本信息，包含人口學基本特征及詳細的臨床病理參數。

1.4 實驗室檢測

1.4.1 腫瘤組織的收集:入選的研究對象經手術切除腫瘤后，立即收集新鮮的腫瘤組織標本，經0.9%氯化鈉溶液沖洗2次浸泡于0.9%氯化鈉溶液中；然后用石蠟包埋，經蘇木精、伊紅染色、中性紅染色，最后由病理醫生采用顯微切割機取10 μm腫瘤組織并確保選中的組織只包含腫瘤組織后，行實時熒光定量PCR實驗定量檢測TS、TP、DPD mRNA表達。

1.4.2 RNA的提取及RT-PCR實驗:切除下的腫瘤組織Trizol法提取RNA，獲得每份樣本的cDNA后，目標cDNA序列通過實時熒光定量PCR實驗進行擴增。RT-PCR的反應體系：600 nmol/L 引物，5 mmol/L MgCl2，200 nmol/L aATP、dCTP、dGTP，400 nmol/L dUTP，總體積25 μl。反應條件：50℃ 10 s；93℃ 10 min；95℃ 15 s 45個循環；95℃ 1 min。本研究所需試劑盒均由北京雅安達生物技術有限公司提供。見表2。

1.5 化療方案 本組120例患者接受5-Fu+左旋咪唑化療68例，5-Fu+四氫葉酸化療方案44例，5-Fu聯合紫杉醇8例，化療劑量均參照說明書的常規劑量。接受化療后每2個化療周期行影像學檢查進行1次療效評估。

1.6 療效評估 參照WHO實體瘤評價標準進行療效評估，標準[5-8]：完全緩解(CR)：全部可測量腫瘤病灶完全消失持續1個月以上；部分緩解(PR)：腫瘤病灶的最大直徑與最大垂直橫徑乘積總和減少1半以上，持續至少1個月；穩定(SD)：腫瘤病灶最大直徑與最大垂直橫徑乘積總和減少<50%或增大<25%，持續至少1個月且無新病灶出現；疾病進展(PD)：病灶的最大直徑與最大垂直橫徑乘積總和增大>25%，或出現新的病灶。無病生存期指從化療開始至疾病進展的時間；總生存期指從化療開始至患者死亡的時間。將CR+PR界定為化療敏感，SD+PD界定為化療不敏感。

表2 RT-PCR實驗所用的引物序列

1.7 隨訪 采用門診隨訪、電話隨訪、信件隨訪等方式對120例結腸癌患者進行隨訪，末次隨訪時間2014年12月。

2 結果

2.1 腫瘤組織與正常組織TS、TP、DPD mRNA相對表達水平比較 2組TS mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，腫瘤組織TPmRNA表達水平明顯高于正常組織，腫瘤組織DPDmRNA表達水平明顯低于正常組織，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

2.2TS、TP、DPDmRNA相對表達相關性分析 經Pearson相關性分析，TS與TP、DPD與TP的mRNA相對表達量之間具有弱正相關關系，DPD與TS的mRNA相對表達量無相關關系。見表3，圖2。

2.3 化療敏感與不敏感組TS、TP、DPDmRNA相對表達水平比較 化療不敏感組TS、TPmRNA表達水平均明顯高于化療敏感組，差異均有統計學意義(P<0.05)，2組DPDmRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表4，圖3。

圖1 腫瘤組織與正常組織TS、TP、DPD mRNA相對表達水平比較

2.4TS、TPmRNA相對表達水平對患者生存預后的影響 本研究采用電話、信件等不同方式對120例患者進行了≥60個月的隨訪，平均隨訪62個月。分別以TS、TPmRNA相對表達水平中位數(TS=1.64;TP=0.27)為界點進行分組，比較2組無瘤生存率及總生存率，經Log-rank檢驗，TS≥1.64組的無瘤生存率(35%)及總生存率(20%)分別低于TS<1.64組(無瘤生存率：65%；總生存率：45%)，差異具均有統計學意義(P=0.013、P=0.043)。TP≥0.27組的無瘤生存率(39%)及總生存率均(20%)分別低于TP<0.27組(無瘤生存率：67.5%；總生存率：60%)，差異也均具有統計學意義(P=0.022、P=0.0017)。見圖4。

圖2 腫瘤組織與正常組織TS、TP、DPD mRNA相對表達相關性分析

2.5 結腸癌患者總生存率的COX回歸分析 以最后一次隨訪的結局為因變量，將患者基本特征、臨床病理參數、TS、TP、DPDmRNA表達水平為自變量，行多元COX回歸分析，腫瘤分化、腫瘤細胞轉移、TSmRNA表達、TPmRNA表達為結腸癌總生存率的獨立危險因素。見表5。

3 討論

雖然手術方案仍是結腸癌的代表性治療手段，但是近期開展的三期臨床試驗結果表明：以5-Fu為基礎的術后輔助化療方案可以明顯改善Ⅲ期結腸癌患者的治療效果和生存預后，5-Fu也可廣泛應用于晚期或轉移性疾病的治療[9-11]。臨床實踐中，除了建立規范化的臨床護理程序外，醫學家們積極尋求可以準確識別對標準化治療方案敏感的惡性腫瘤患者的技術手段，這不僅可以提高治療效率，還可將治療效果最優化。這些方法包括評估腫瘤病灶的惡性程度、檢測可以引起腫瘤復發的最小殘留等。近年來，與化療藥物代謝或藥效作用機制相關的關鍵酶或基因的表達水平檢測也越來越多的用于臨床實踐，并發揮了越來越重要的作用[12-16]。5-Fu可通過三種不同途徑被磷酸化作用轉化為無活性代謝物。TS、TP和DPD均是上述途徑的關鍵酶。上述關鍵酶的表達水平在預測結腸癌患者以5-Fu為基礎的化療療效及預后預測中發揮著重要作用。有研究表明,5-Fu可以抑制TS的分泌，同時上述三種關鍵酶的調控基因的表達與消化道惡性腫瘤的輔助化療敏感性相關，可以為腫瘤患者的個體化治療方案的制定提供參考[16-18]。

圖3 化療敏感與不敏感組TS、TP、DPD mRNA相對表達比較

圖4 不同TP、TS mRNA表達水平組生存曲線比較(Log-rank檢驗)

表3 腫瘤組織與正常組織TS、TP、DPD mRNA相對表達相關性分析

類別TSTPDPD化療敏感(n=56) 1.03±0.290.32±0.0910.96±7.81化療不敏感(m=64)2.06±0.400.37±0.2312.98±9.86t值6.2552.2361.549P值0.0060.0460.129

表5 結腸癌患者總生存率的COX回歸分析

TS是一種由相同亞基構成的同源二聚體胞漿酶，是體內脫氧核糖核酸(DNA)生物合成所需的胸腺嘧啶核苷酸的起始合成過程的限速酶。若細胞無外源性的胸腺嘧啶供應，這一限速反應是體內胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTMP)的惟一來源。腫瘤細胞在沒有外源性的胸腺嘧啶的情況下，TS活性將對腫瘤細胞內胸腺嘧啶的合成起關鍵作用，可以影響腫瘤細胞的DNA合成、裂解以及凋亡[15,17,19]。TP是影響嘧啶核苷合成、分解的關鍵酶，目前已證實在許多實體瘤組織中均有表達。TP酶與腫瘤的生長、轉移密切相關，還可影響腫瘤細胞對5-Fu為基礎的化療藥物的敏感性[3]。DPD是5-Fu分解代謝的起始酶和限速酶，體內80%以上的5-Fu通過DPD不可逆地代謝為無活性的產物。上述研究結論提示：TS、TP、DPD在惡性腫瘤的發生、發展和治療總起著重要的作用，并影響腫瘤細胞對5-Fu為基礎的化療藥物的敏感性[1,3,20]。因此，我們推測采用TS、TP、DPD表達水平預測中晚期結腸癌的化療效果及預后應該具有重要的價值。

為了證實上述推測，本研究采用前瞻性觀察設計，隨訪術后采用5-Fu為基礎的化療方案的120例Ⅱ、Ⅲ期的結腸癌患者。重點分析TS、TP、DPD表達水平與化療效果的關系及在預測生存預后中的臨床價值。分析結果提示：腫瘤組織的TPmRNA表達水平明顯高于正常組織，腫瘤組織的DPDmRNA表達水平明顯低于正常組織(P<0.01)。經相關性分析，TS與TP、DPD與TP的mRNA相對表達量之間具有弱正相關關系。另外，TS、TPmRNA的高表達更傾向于對5-Fu化療藥物不敏感，且與中晚期結腸癌較差的預后有關。本研究還對影響結腸癌患者總生存率的影響因素進行了多元COX回歸分析，結果提示：除了腫瘤分化、腫瘤細胞轉移等傳統的惡性腫瘤危險因素外，TSmRNA表達、TPmRNA表達也是影響結腸癌總生存率的獨立危險因素。

綜上所述，本研究結果顯示：Ⅱ、Ⅲ期結腸癌TS、TP高表達患者更傾向于對5-Fu化療藥物不敏感且生存預后較差，TS、TP表達對臨床制定個體化的化療方案具有一定的指導價值，但仍需大樣本、多中心、前瞻性的臨床研究進一步證實。

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Correlation between the expression levels of TS,TP,DPD and clinical outcome in patients with phase Ⅱ,Ⅲ colon cancer receiving fluorouracil-based chemotherapy

JINGuoquan,LIMiao.

DepartmentofOncologicalSurgery,QinghaiProvincialCancerHospital,Xining810007,China

Objective To investigate the correlation between the expression levels of thymidylate synthase (TS),thymidine phosphorylase (TP), dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) and clinical outcome in patients with phase II,III colon cancer receiving fluorouracil-based chemotherapy.Methods One hundred and twenty patients with phase II,III colon cancer who received postoperative fluorouracil-based chemotherapy were enrolled in the study. Real-time quantitative PCR (RT-PCR) analysis was used to detect the expression levels of TS,TP,DPD.Morever the correlation between the expression levels and therapeutic effects of chemotherapy as well as patient's prognosis was analyzed.Results The expression levels of TP mRNA in tumor tissues were significantly higher than those in normal tissue,however,the expression levels of DPD mRNA in tumor tissues were significantly lower than those in normal tissues (P<0.01).ThecorrelationanalysisshowedthattherewasaweakpositivecorrelationbetweenTSandTPandbetweenDPDandTP(r2=0.04937,P<0.01;r2=0.08345,P<0.01).ThehighexpressionsofTS,TPmRNAweremoreinclinedtobeinsensitiveto5-Fuchemotherapyanddiseasefreesurvivalandoverallsurvivalrateswerelower(P<0.01).ThemultivariateCOXregressionanalysisshowedthatinadditiontotraditionalriskfactorsincludingtumordifferentiationandtumorcellmetastasis,theexpressionsofTSandTPmRNAwerealsoindependentriskfactorsinfluncingcoloncanceroverallsurvivalratea(OR=2.036,95%C.I.:1.896～3.656;OR=2.426,95%C.I.:2.037～2.945).Conclusion The high expressions of TS,TP are more more inclined to be insensitive to 5-Fu chemotherapy,with poor prognosis in patients with phase Ⅱ,Ⅲ colon cancer,thus,the expressions of TS and TP have certain instructive value for instituting individualized chemotherapy scheme in clinical practice.

colon cancer; thymidylate synthase; thymidine phosphorylase; dihydropyrimidine dehydrogenase

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.06.001

810007 西寧市，青海省腫瘤醫院腫瘤外科(晉國權),腫瘤內科(李淼)

李淼，810007 西寧市，青海省腫瘤醫院腫瘤內科；

E-mail：limiao1979@126.com

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1002-7386(2017)06-0805-05

2016-07-10)