苦參素通過p38/JNK信號途徑對海馬神經元凋亡的影響

蔡艷+蔣偉+周愛玲+趙敏+徐玲

[摘要] 探討苦參素（oxymatrine，OMT）對海馬神經元凋亡的影響及其機制。采用MTT法測定OMT對海馬神經元存活率的影響；生物化學法測定OMT對LPS誘導的海馬神經元乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放率的影響；Hochest 33342染色觀察海馬神經元凋亡形態；實時定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）方法檢測海馬神經元中Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA的表達；蛋白免疫印跡法（Western blot，WB）檢測海馬神經元中p38，p-p38，JNK，p-JNK，Bax，Bcl-2和Caspase-3的表達。結果發現，不同劑量的OMT（0.37～6.0 g·L-1）和海馬神經元共培養24 h，海馬神經元生長狀態良好；LPS刺激后，海馬神經元LDH釋放率增加（P<0.01），JNK和p38的磷酸化水平明顯增加（P<0.01），Bax/Bcl-2的比例及Caspase-3的表達上調（P<0.01），海馬神經元凋亡增加。OMT預處理后，能明顯降低海馬神經元經LPS刺激后的LDH釋放（P<0.05或P<0.01），減少p38和JNK磷酸化水平，降低Bax/Bcl-2的比例及Caspase-3的表達（P<0.01），海馬神經元凋亡減少。綜上，OMT能降低經LPS激活的p38和JNK磷酸化水平，下調Bax/Bcl-2的比例和Caspase-3的表達，從而抑制海馬神經元凋亡。OMT通過p38/JNK信號途徑抑制海馬神經元的凋亡。

[關鍵詞] 苦參素； 海馬神經元； 細胞凋亡； p38/JNK

[Abstract] To investigate the effect and mechanism of oxymatrine（OMT） on hippocampal neurons apoptosis. Effect of OMT on survival of hippocampal neurons was measured by MTT.Effect of OMT on LPS-induced lactate dehydrogenase（LDH） release rate in hippocampal neurons was measured by biochemical methods. Hoechst 33342 staining was used to observe the apoptotic morphology of hippocampal neurons.The mRNA expression levels of Bax， Bcl-2， and Caspase-3 were detected by Real-time quantitative PCR（RT-qPCR）， and the protein expression levels of p38， p-p38， JNK， p-JNK， Bax， Bcl-2 and Caspase-3 were detected by Western blot.The results showed that， hippocampal neurons all grew well after treatment by different doses （0.37-6.0 g·L-1） of OMT for 24 h. Stimulation from LPS increased the release of LDH（P<0.01）， improved the JNK and p38 phosphorylation levels（P<0.01）， increased the proportion of Bax/Bcl-2 and the expression of Caspase-3（P<0.01）， and promoted the apoptosis of hippocampal neurons. OMT pretreatment could significantly reduce the release of LDH induced by LPS stimulation（P<0.05 or P<0.01）， reduce the p38 and JNK phosphorylation， decrease the expression of Caspase-3 and Bax/Bcl-2（P<0.01）， and diminish the apoptosis of hippocampal neurons.In conclusion， OMT could reduce the LPS-induced phosphorylation of p38 and JNK， down-regulate the Bax/Bcl-2 ratio and expression of Caspase-3， thus inhibiting apoptosis of hippocampal neurons. The mechanism may be associated with p38/JNK signaling pathway.

[Key words] oxymatrine； hippocampal neurons； apoptosis； p38/JNK

神經退行性疾病（neurodegenerative disease，ND）是一類慢性、進行性神經系統疾病，神經細胞退行性病變是它們的共同特點。在大多數ND中，尤其是阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD） 特征性病理變化之一是腦內神經元數目明顯減少，以海馬區和基底前腦受累最為嚴重，神經元減少平均可達47%。近年來認為細胞凋亡（apoptosis）是引起AD神經元數目減少的重要原因[1-3]。

然而，目前尚無有效的藥物阻止或抑制AD腦組織中神經元的凋亡。苦參素（oxymatrine，OMT）是從苦參、苦豆子及廣豆根中分離提純出來的生物堿，具有四環的喹嗪啶結構，藥理和臨床試驗證明，OMT可減少多種炎癥因子的活化，具有抗凋亡的藥理作用[4]。本課題組前期研究發現，OMT 能明顯抑制由LPS誘導的大鼠腦內炎癥反應，保護神經元[5]。但對神經退行性疾病如AD神經元凋亡的影響及其機制未見報道。

本項目以非甾體抗炎藥阿司匹林（aspirin/acetylsalicylic acid，ASA）為陽性藥對照[6]，應用不同劑量的OMT分別預處理海馬神經元，再用LPS刺激海馬神經元，運用實時定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）和蛋白免疫印跡法（Western blot，WB）等方法探討OMT通過p38/JNK信號途徑對海馬神經元凋亡的影響及其可能機制。通過上述研究，期望在理論上為OMT在抑制海馬神經元凋亡作用方面提供更多的實驗依據。

1 材料

1.1 動物 新生1 d的SD大鼠，SPF級，由南通大學實驗動物中心提供，許可證號SYXK（蘇）2012-0031。

1.2 儀器 細胞培養板（Corning 公司，美國）；細胞培養箱（Jouan公司，法國）；超凈工作臺（蘇州華宏凈化技術有限公司）；各種型號的移液器（Eppendorf公司，德國）；XDS-1B倒置生物顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；PTC-100 PCR儀（美國Bio-Rad公司）；Eppendorf核酸蛋白分析儀（德國Eppendorf公司）；Elx800全自動酶標儀（美國寶特儀器有限公司）；Mini protein-3電泳裝置（美國Bio-Rad公司）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）；電熱恒溫干燥箱（上海華聯環境實驗設備公司恒溫儀器廠）；電熱恒溫水槽（上海華聯環境實驗設備公司恒溫儀器廠）；PB-10 pH計（北京塞多利斯公司）；TY-80S脫色搖床（南京新校園生物技術研究所）。

1.3 藥品與試劑 苦參素（寶雞市方晟生物開發有限公司，批號F20110322），MTT（Fluka公司），LPS（Sigma，USA），BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）（海門碧云天生物技術研究所，編號P0010S），十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulphate，SDS）（國藥集團化學試劑有限公司，批號F20080521），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜（MILLIPORE），預染蛋白質標準（Fermentas，批號00067755），SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（Fermentas，批號00066150），GENMED 乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒 （GENMED SCIENTIFICS INC.U.S.A，編號GMS10073v.A），兔抗Caspase-3多克隆抗體（rabbit anti-Caspase-3 polyclonal antibody，Santa Cruz，USA），兔抗Bax多克隆抗體（rabbit anti-Bax polyclonal antibody，Santa Cruz，USA），兔抗Bcl-2多克隆抗體（rabbit anti-Bcl-2 polyclonal antibody，Santa Cruz，USA），鼠抗β-actin單克隆抗體（mouse anti-β-actin monoclonal antibody，Santa Cruz，編號sc-81178），JNK Rabbit Monoclonal Antibody （Epitomics，3496-1），JNK Phospho Rabbit Monoclonal Antibody （Epitomics，2155-1），p38 MAPK Rabbit Monoclonal Antibody （Epitomics，1544-1），p38 MAPK Phospho Rabbit Monoclonal Antibody （Epitomics，1229-1），Trizol reagent（Invitrogen），PCR引物由上海睿強生物科技有限公司設計和合成（表1）。

2 方法

2.1 OMT對海馬神經元存活率的影響 原代培養大鼠海馬神經元懸液，調整細胞密度為1×104個/mL，接種于96孔培養板中培養7 d左右，分為正常對照組和不同質量濃度的OMT（0.37，0.75，1.5，3.0，6.0 g·L-1）[7]組。吸去各組的培養基，不同濃度的OMT組：為含有相應濃度OMT的培養基，正常對照組換為等體積的培養基，孵育24 h，用MTT法檢測各組海馬神經元的存活率。

實驗步驟：吸去96孔板的細胞原培養液，每個孔加入25 μL MTT，37 ℃孵育4 h后棄去上清液，每孔加入100 μL 20%SDS溶液，37 ℃孵育24 h，570 nm波長處測定其吸光度。以正常對照組的細胞活力為100%，計算各實驗組細胞的存活百分率。細胞存活率=（給藥組的細胞活力÷正常對照組的細胞活力）×100%。實驗重復6次。

2.2 不同濃度OMT預處理對LPS誘導的海馬神經元LDH釋放率的影響 把海馬神經元接種于96孔培養板培養7 d左右，分為正常對照組和不同濃度的OMT（0，0.37，0.75，1.5，3.0，6.0 g·L-1）預處理組。不同濃度的OMT預處理組：根據前期研究結果及參考文獻方法[7-8]，采用含有相應濃度OMT的培養基孵育3 h后，再加入終質量濃度為10 mg·L-1的 LPS作用24 h，正常對照組加入等體積的培養基，用乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒測定各組海馬神經元的LDH的釋放量。具體步驟參考LDH試劑盒說明書，實驗重復6次。

2.3 Hochest 33342染色觀察海馬神經元凋亡形態 實驗分組：①正常對照組（僅加入培養基）；②LPS組（10 mg·L-1）；③ASA（5.0 mmol·L-1）[9]+LPS（10 mg·L-1）組（陽性藥對照組）；④OMT中劑量（1.5 g·L-1）+LPS（10 mg·L-1）組。具體步驟如下：于玻片上將培養7 d的海馬神經細胞，采用OMT預處理3 h 后，加入終濃度為10 mg·L-1的LPS，作用24 h。取出玻片進行免疫熒光化學染色，進行沖洗。4%多聚甲醛4 ℃固定。10%山羊血清室溫封閉1 h棄血清，再次沖洗。Hoechst 33342（1∶1 000稀釋）室溫15 min，ddH2O沖洗。用抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察細胞核形態學的變化，進行凋亡核計數并隨機拍照。

2.4 RT-qPCR法檢測OMT預處理對LPS誘導的海馬神經元Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA的表達變化 原代培養大鼠海馬神經元，實驗分成7組：①正常對照組（Normal組，僅加入培養基）；②脂多糖組（LPS組，10 mg·L-1）；③阿司匹林+脂多糖組（ASA+LPS組，5.0 mmol·L-1+10 mg·L-1）；④苦參素組（OMT，1.5 g·L-1）；⑤苦參素低劑量+脂多糖組（OMT-L+LPS組，0.75 g·L-1+10 mg·L-1）；⑥苦參素中劑量+脂多糖組（OMT-M+LPS組，1.5 g·L-1+10 mg·L-1）；⑦苦參素高劑量+脂多糖組（OMT-H+LPS組，3.0 g·L-1+10 mg·L-1），提取細胞總RNA用于Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA測定。按照文獻方法操作[10]。

2.5 Western blot 法檢測OMT預處理對LPS誘導的海馬神經元p38，p-p38，JNK，p-JNK，Bax，Bcl-2及Caspase-3的表達變化 取原代培養7 d的細胞，換成無血清培養基，實驗分組同RT-qPCR法，蛋白質濃度用BCA法檢測，蛋白印跡結果重復3次，用ImageJ軟件進行灰度分析，GraphPad Prism 5軟件分析統計各組特異性蛋白質表達量（均以β-actin為內參）。

2.6 數據處理與統計分析 實驗數據用±s表示，用GraphPad Prism 5統計軟件進行方差分析和兩兩比較，對數據進行統計學分析，以P<0.05為有統計學意義。

3 結果

3.1 OMT對海馬神經元存活率的影響 以對照組細胞活力為100%，按公式計算出各組細胞存活率。結果可見，與對照組相比，不同濃度的OMT各給藥組之間沒有明顯統計學差異。結果顯示不同濃度的OMT（0.37～6.0 g·L-1）和海馬神經元共培養24 h，海馬神經元生長狀態比較好。

3.2 不同濃度OMT預處理對LPS誘導的海馬神經元LDH釋放率的影響 觀察不同濃度的OMT對LPS誘導的海馬神經元的毒性（LDH釋放率）作用。結果可見，與對照組相比，LPS組的海馬神經元的LDH釋放率明顯增大（P<0.01）。與LPS組相比，不同濃度的OMT能夠明顯降低LPS誘導的海馬神經元的LDH釋放率（P<0.05或P<0.01），且在一定濃度范圍內隨著OMT濃度的增大，降低LDH釋放率的作用呈增大趨勢。但OMT在低質量濃度0.37 g·L-1減少LPS誘導LDH釋放率相對較弱，而OMT在3.0，6.0 g·L-1時LDH釋放率沒有明顯統計學差異。因此，本實驗選擇OMT為0.75，1.5，3.0 g·L-1進行后續實驗，見圖1。

3.3 Hochest 33342 染色觀察各組海馬神經元凋亡形態 各組海馬神經元Hoechst 33342染色，結果顯示正常的海馬神經元核為圓形或者卵圓型，染色均勻。而一部分神經元核呈凹陷狀或碎塊狀，染色不均或者濃染，可能為凋亡細胞。與正常對照組相比，LPS組凋亡細胞相對較多。與LPS組相比，ASA+LPS組和OMT+LPS組凋亡細胞顯著減少，見圖2。

3.4 Western blot法檢測各組海馬神經元p-38及p-p38蛋白的表達 對照組海馬神經元中p38磷酸化蛋白表達相對較少。與對照組相比，LPS組p38磷酸化蛋白的表達明顯上調（P<0.01）。與LPS組相比，ASA+LPS組能夠明顯降低LPS誘導的p38磷酸化蛋白表達的增高（P<0.01）；各劑量OMT+LPS組能減弱LPS誘導的p38磷酸化蛋白表達的作用，且在一定的劑量范圍內隨OMT的劑量增大，作用增強（P<0.05或P<0.01），見圖3。

3.5 Western blot法檢測各組海馬神經元JNK及p-JNK蛋白的表達 對照組海馬神經元中JNK磷酸化蛋白表達相對較少。與對照組相比，LPS組JNK磷酸化蛋白的表達明顯上調（P<0.01）；OMT組與對照組相比，JNK磷酸化蛋白表達沒有顯著統計學意義。與LPS組相比，ASA+LPS組JNK磷酸化蛋白表達明顯下調（P<0.01）；各劑量OMT+LPS組能夠明顯降低LPS誘導的JNK磷酸化蛋白表達的增高（P<0.05或P<0.01），且在一定劑量范圍內隨著OMT劑量增大，JNK磷酸化蛋白的表達逐漸減少，見圖4

3.6 RT-qPCR檢測各組海馬神經元中Bax，Bcl-2mRNA的表達變化 與對照組相比，LPS組Bax/Bcl-2 mRNA的比例明顯增高（P<0.01）。與LPS組相比，ASA+LPS組Bax/Bcl-2 mRNA的比例明顯降低（P<0.01）；各劑量OMT+LPS組Bax/Bcl-2 mRNA的比例顯著低于LPS組（P<0.01），見圖5。

OMT+LPS組在一定的劑量范圍內隨OMT劑量的增大，Bax/Bcl-2比例和Caspase-3蛋白的表達呈遞減趨勢，具有統計學意義（P<0.01），見圖7。

3.7 RT-qPCR檢測各組海馬神經元中Caspase-3 mRNA的表達變化 對照組海馬神經元中Caspase-3 mRNA的表達相對較少。與對照組相比，LPS組Caspase-3 mRNA表達明顯增多（P<0.01）。與LPS組相比，ASA+LPS組能夠明顯降低LPS誘導的Caspase-3 mRNA的表達增多，且具有統計學意義（P<0.01）；各劑量OMT+LPS組在一定劑量范圍內隨著OMT劑量的增大，其降低LPS誘導的海馬神經元中Caspase-3 mRNA表達增多的效果也逐漸增強。（P<0.05或 P<0.01），見圖6。

3.8 Western blot法檢測各組海馬神經元中Bax，Bcl-2及Caspase-3蛋白的表達 對照組中，Bax/Bcl-2比例和Caspase-3蛋白的表達比較少。與對照組相比，LPS組Bax/Bcl-2比例和Caspase-3蛋白的表達明顯上調（P<0.01）；OMT組Bax/Bcl-2比例和 Caspase-3蛋白的表達沒有明顯統計學差異。與LPS組相比，ASA+LPS組能夠明顯下調Bax/Bcl-2比例和Caspase-3蛋白的表達（P<0.01）；各劑量OMT+LPS組在一定的劑量范圍內隨OMT劑量的增大，Bax/Bcl-2比例和Caspase-3蛋白的表達呈遞減趨勢，具有統計學意義（P<0.01），見圖7。

4 討論

阿爾茨海默病（AD）、肌萎縮性脊髓側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和帕金森綜合征（Parkinson′s syndrome，PD）等神經退行性疾病，在海馬區和基底前腦等腦組織的神經元發生了凋亡。但目前尚無有效藥物阻抑神經元的凋亡。OMT具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗過敏等藥理作用[11] ，可抑制核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB），降低多種炎癥因子的活化，具有抗凋亡的藥理作用。

然而，OMT對海馬神經元凋亡的影響及其機制尚不清楚。

4.1 OMT能降低海馬神經元LDH 釋放率抑制細胞凋亡 OMT預處理對LPS誘導的海馬神經元LDH釋放率結果顯示，LPS對海馬神經細胞膜有毒性作用，OMT在適當的劑量范圍內，能明顯減少LPS誘導的LDH釋放率，對海馬神經細胞膜有保護作用。Hochest染色法結果可見，LPS刺激后對海馬神經元的毒性作用引起了細胞凋亡；OMT預處理可以明顯抑制LPS誘導的海馬神經元凋亡。

4.2 OMT能降低LPS誘導的海馬神經元JNK和p38磷酸化水平 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一類絲/蘇氨酸殘基的蛋白激酶。MAPK的作用是將信號從細胞表面轉導到細胞核內的十分重要傳遞者。MAPK信號轉導通路中主要有，p38通路、c-Jim氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路、細胞外信號調節蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinases，ERK） 通路。p38已經被證實在PC12和小腦顆粒細胞的凋亡調控的過程中有著非常重要的作用，而且p38在被胰島素預處理過培養的新生神經細胞中將會失活[12-13]。p38被磷酸化，表明了p38激活。JNK途徑的激活參與了不同刺激所致凋亡的啟動。JNK激活不僅參與了藥物誘導的凋亡，而且參與了一些DNA損傷刺激引起的凋亡[14]。JNK的磷酸化產物p-JNK標志著JNK激活。ERK 信號通路在神經細胞凋亡中具有雙重作用，即既有抗凋亡作用，也有促進凋亡作用，因其作用的復雜性，故本實驗采用了LPS剌激海馬神經元，Western blot檢測p38，JNK及其磷酸化蛋白的表達變化。LPS能明顯上調p38和JNK磷酸化蛋白的表達，p38和JNK被激活，從而促進海馬神經元的凋亡。各劑量OMT預處理能夠明顯降低LPS誘導的海馬神經元JNK和p38磷酸化水平，從而抑制海馬神經元凋亡。OMT抑制LPS誘導的海馬神經元凋亡與降低p-JNK，p-p38有關。

4.3 OMT預處理能降低海馬神經元Bax/Bcl-2的比例及Caspase-3的表達 OMT能降低p-JNK與p-p38的表達，然后又通過何種機制抑制LPS誘導的海馬神經元凋亡？近年來研究發現，JNK能介導多種細胞外刺激引起細胞凋亡，參與了多種細胞凋亡的發生[15]。活化后的JNK有一部分存在于細胞質內，可以通過磷酸化作用直接調節Bcl-2家族成員（Bim，Bax，Bcl-2等）的活性，從而誘導線粒體途徑的細胞凋亡[16] 。在Bcl-2家族成員中，Bax在線粒體細胞凋亡途徑中發揮著主要作用。活化的JNK一方面能夠磷酸化激活Bax，Bim等，同時又可以抑制Bcl-2等抗凋亡蛋白。活化的Bax移位至線粒體外膜，使線粒體膜通透性增高釋放Cyt C，Smac/DIABLO及凋亡誘導因子等促進凋亡的線粒體蛋白[17]。釋放到細胞質中的Cyt C與凋亡酶激活因子-1（Apaf-1）等結合形成凋亡復合體，從而誘導Caspase依賴的線粒體途徑的細胞凋亡。激活后的p38能夠活化Caspase-3， 啟動細胞凋亡信號通路，活化的Caspase-3又進一步切割不同的底物，使蛋白酶級聯反應不斷放大，促使細胞凋亡。Liu等研究發現磷酸化的p38還能夠上調Fas/FasL，引起Caspase-3活化，認為p38在細胞凋亡過程中發揮了雙重作用，但細胞的凋亡最終都是通過活化Caspase-3完成的[18]。

Bcl-2基因家族包括兩大類：一類是凋亡抑制基因：Bcl-2，Bcl-x1等；另一類是促凋亡基因：Bax，Bak等，Bax蛋白具有對抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用，Bax與Bcl-2在體內通過結合形成二聚體而發揮作用。當Bax與Bcl-2表達相平衡時，細胞的存活期正常；當Bcl-2高表達，而Bax的表達未相應增多時，Bax與Bcl-2形成異型二聚體發揮作用，抑制凋亡的發生，細胞的存活期延長；當Bax高表達，而Bcl-2形成同型二聚體，啟動Caspase酶系級聯反應促進細胞凋亡。因此，Bax/Bcl-2比值的變化較單一的Bax或者Bcl-2的表達更可靠和敏感，更可以作為檢測細胞是否發生凋亡的指標之一。

綜上所述，LPS通過上調海馬神經元p38和JNK磷酸化蛋白水平，p38和JNK被激活，使Bax/Bcl-2的比例和Caspase-3表達增加，從而促進海馬神經元的凋亡。各劑量OMT預處理能夠明顯降低LPS誘導的海馬神經元JNK和p38磷酸化水平，使Bax/Bcl-2的比例和Caspase-3表達減少，從而抑制海馬神經元凋亡。

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