結核病療效監測技術及指標研究進展*

陳云坤，王 勇 綜述，馮英凱△ 審校

(1.重慶市中醫院道門口院部呼吸內科 400011；2.重慶市公共衛生醫療救治中心普內科，重慶 400036)

結核病療效監測技術及指標研究進展*

陳云坤1，王 勇2綜述，馮英凱1△審校

(1.重慶市中醫院道門口院部呼吸內科 400011；2.重慶市公共衛生醫療救治中心普內科，重慶 400036)

結核；療效監測；抗結核治療

世界衛生組織2016年全球結核病報告顯示,全球結核病死亡數量和發病率均繼續下降。2015年，據估計全世界新發結核病數量約為1 040萬例，其中590萬為男性(56%)，350萬為女性(占34%)，100萬為兒童(10%)[1]。120萬新發結核病例為艾滋病毒感染者(11%)。印度、印度尼西亞、中國、尼日利亞、巴基斯坦和南非這6個國家占新發病例數的60%，中國結核病患者人數居世界第3。2015年，據估計有140萬人死于結核病，還有40萬艾滋病毒感染者死于結核病。雖然從2000-2015年結核病死亡數量下降了22%，但結核病仍是2015年全世界十大死因之一。

早期確診和提高治愈率是控制結核病的現實目標。結核病的治療多采用聯合化療方案，遵循“早期、聯合、適量、規律、全程”的原則。由于結核化療藥物不良反應嚴重，加之缺乏靈敏、有效的療效監測指標，相當一部分患者服藥依從性較差，特別是西部欠發達地區,經濟及文化落后,患者往往一旦自覺癥狀改善即自行停藥，導致治療失敗或產生耐藥。采取正確合理的治療方案、提高患者服藥依從性是實施結核化療成功的關鍵。縮短和簡化療程是減少化療藥物不良反應、提高服藥依從性的重要手段之一。而實施短程化療必須建立在實時掌握結核患者病情變化和療效的基礎之上，否則，治療的成功與否便無據可依。目前國內外學者對其療效監測技術和指標做了大量的研究，除了傳統手段以外，分子生物學、內鏡、超聲等技術在結核病的診療和效果觀察中發揮越來越多的優勢[2]。現對其研究進展作一綜述。

1 目前常用的肺結核療效判定方法

目前臨床上觀察肺結核病情變化的常用方法有痰涂片鏡檢、傳統改良羅氏培養法、結核菌素試驗(TST)等，病情變化的標志為癥狀改善、痰菌陰轉、病灶吸收、空洞閉合等。

1.1結核桿菌檢查 最經典的肺結核療效判定方法為：(1)痰或呼吸道分泌物(通過纖支鏡檢吸取分泌物、鏡下毛刷取材、活檢、支氣管肺泡灌液等直接涂片和應用集菌法)涂片應用萋尼抗酸染色法行抗酸桿菌檢查。(2)結核桿菌培養。選擇痰或呼吸道分泌物、胸腔積液、腹水、腦脊液等行結核桿菌培養。培養基從性狀上分主要有固體培養基(如羅氏培養基)、液體培養基(蘇通培養基)、半流體培養基(改良蘇通半流體瓊脂培養基)、固液雙相培養基(Septi-Check AFB雙相培養基)等類型。(3)病理學檢查。通過肺活檢、胸膜活檢、淋巴結活檢、手術切除等留取可疑結核組織，固定、切片，行病理學檢查。病理學檢查結果被視為結核診斷的金標準，不足之處是其敏感度差，陽性率較低。

1.2胸部X線片檢查 X線片是早期發現肺結核病的重要手段，且通過胸部X線片可以了解肺結核病灶吸收、空洞閉合情況。王國慶[3]通過對120例痰菌和聚合酶鏈反應(PCR)陽性肺結核患者，選擇6個月短程方案，并在X線片下動態觀察病灶變化，發現原病灶吸收、縮小、纖維化、消散，鈣化及自覺癥狀消失，體質恢復，得出X線片變化可作為化療效果的判斷指標。并且X線片檢測應用普及，覆蓋面廣，一般醫院都能開展，使用方便，在結核病防治工作中仍是必不可缺少的檢查手段。不足之處是其特異度低、缺乏明確的評價標準；時效性差，不能實時反映抗結核療效，存在滯后性。

1.3紅細胞沉降率(ESR) ESR是一種經典急性期反應標志物，常用來監測炎癥狀態的發生和轉歸，還可作為疾病活動與否的監測指標，以及監測疾病嚴重程度。Mesquita等[4]通過研究發現，在抗結核病治療過程中ESR水平明顯下降，結果表明ESR可以作為結核病患者療效及預后的參考指標。不足之處是其特異度低，除結核以外，各種炎癥性疾病、急性全身性或局部性感染、自身免疫性疾病、嚴重貧血、血液病、慢性肝炎、肝硬化、多發性骨髓瘤、甲狀腺功能亢進、重金屬中毒、惡性淋巴瘤、巨球蛋白血癥、慢性腎炎等疾病時，ESR也可明顯加快。

1.4結核菌素皮膚試驗(TST) 該試驗具有操作簡單易行、成本低廉、可目視反應結果等優點。但TST所用的純化蛋白質衍生物是從結核分枝桿菌中粗提的抗原混合物，與牛結核分枝桿菌減毒株(卡介苗)，以及非結核分枝桿菌的抗原，都存在交叉反應，易出現較高的假陽性率，特異度低，且無法區別既往及現患結核。而對于營養不良、器官移植、免疫系統功能低下的結核病患者而言，該方法的靈敏度較低。

2 血清學檢查

2.1C反應蛋白(CRP) CRP是一種非特異性的急性期蛋白，在組織損傷急性期，CRP會相應增高。Mendy等[5]通過對肺結核患者抗結核病治療前后CRP的動態監測，發現通過2個月的抗結核治療，其CRP水平顯著下降，通過6個月治療后其CRP水平進一步下降，結果表明CRP可以作為評估抗結核治療療效的一個指標。國外其他學者也通過研究發現，監測CRP水平可以評估抗結核病治療效果[6-7]。

2.2降鈣素原(PCT) PCT是降鈣素的前體物質，當PCT水平升高時，可以反映炎性反應的活躍程度。徐立等[8]將抗結核治療的患者(觀察組)與未行抗結核治療的患者(對照組)相比較，結果顯示觀察組患者抗結核治療后1、3、6個月后，血清降鈣素原水平明顯降低，顯著低于對照組水平，提示血清降鈣素原可以作為抗結核治療療效評估的指標之一。

2.3其他 一些學者也發現β2微球蛋白[5]、血清球蛋白[9]、血清清蛋白(ALB)、補體成分3(C3)、和載脂蛋白(a)(LPA)[10]、血小板計數[11]可作為結核病診斷、療效、活動判斷的重要輔助指標之一。

3 免疫學

3.1γ-干擾素釋放試驗(IGRA) IGRA是一種體外免疫檢測方法，當結核特異性抗原[如早期分泌抗原靶分子6(ESAT-6)、培養濾液蛋白10(CFP-10)]刺激結核菌抗原致敏的T淋巴細胞時，效應記憶T淋巴細胞產生并分泌γ-干擾素(IFN-γ)，通過檢測IFN-γ水平，可以評估抗結核治療療效。目前，IGRA有結核分支桿菌γ-干擾素體外釋放定量試驗(TB-IGRA，濃度法)和結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB，斑點法)。

3.2TB-IGRA 有研究發現，效應記憶T淋巴細胞只在人體內存在結核分支桿菌(MTB)時產生，當結核病治愈后即消失，故抗原特異性IFN-γ體外釋放測定只與體內MTB負荷量即結核活動性呈正相關，而不受既往結核感染的影響，從而成為評估抗結核治療療效的理想指標[12]。且多項研究發現，TB-IGRA的動態監測可用于評估抗結核治療療效，當抗結核治療有效時，TB-IGRA結果會下降，甚至轉陰；若TB-IGRA結果長期無明顯改善，可能提示抗結核效果不滿意[13-15]。

3.3T-SPOT.TB T-SPOT.TB是運用酶聯免疫斑點法(ELISPOT)檢測結核分支桿菌感染后T淋巴細胞分泌的特異性細胞因子IFN-γ來判斷結核感染狀態，該方法能快速而敏感地診斷結核。一項研究發現，抗結核治療3個月后有62例患者復查T-SPOT.TB，6個月后有54例患者復查T-SPOT.TB，其抗原A(ESAT-6)與抗原B(CFP-10)的特異性斑點形成細胞中位數均顯著低于治療前，T-SPOT.TB可以作為抗結核治療的效果評價指標[16]。但是該方法也存在一定的不足之處，如無法區分活動性和潛伏性結核感染、操作復雜、試劑成本昂貴等。盡管有Meta分析指出，IGRA對于診斷兒童肺結核的敏感度具有一定參考價值，但IGRA單獨用于診斷活動性結核病尚缺乏充足的臨床證據支持。IGRA診斷活動性結核敏感度高于結核菌素(OT)、純蛋白衍生物皮試(PPD)，但特異度較低，會導致部分患者被誤診為活動性結核。

3.4流式細胞術(FCM) FCM是利用流式細胞儀對處于液流中的單個細胞或生物顆粒進行定性、定量分析和分選的技術。有學者通過流式細胞術分析研究發現，在抗結核病治療中患者CD4+T淋巴細胞、Th1細胞水平升高，Th2細胞水平降低，提示外周血CD4+T淋巴細胞及其亞型(Th1/Th2)細胞水平可以判斷病情變化及治療效果[17]。利用流式細胞術研究發現患者CD4+Tim1+細胞和CD3+CD19+CD5+Tim1+細胞在抗結核治療后明顯下降，提示CD4+Tim1+細胞和CD3+CD19+CD5+Tim1+細胞可以作為療效考核的參考指標[18]。利用流式細胞術研究發現雙陰性細胞(DNT)、雙陽性細胞(DPT)百分含量減少，提示DNT和DPT可作為判斷結核患者免疫狀態、指導用藥和療效觀察的指標[19]。

3.5酶聯免疫吸附法(ELISA) ELISA是將抗原與抗體的特異性反應和酶的催化反應相結合，從而建立的一種特異而敏感的技術，可以進行定性或定量測定。一些學者通過運用ELISA對比研究發現，在抗結核治療過程中血清白細胞介素(IL)-6水平迅速下降，得出監測血清IL-6水平可能對監測抗結核治療的臨床效果是有用的[20-21]。還有些學者運用ELISA發現趨化因子IP-10可作為鑒別結核感染的階段之間和監測治療效果的診斷標志物[22-23]。

3.5液相芯片技術 液相芯片技術是將DNA、抗體等附著于微球表面作為探針，在液相中與待測物結合，再加入熒光標記的報告分子，借助流式細胞儀檢測微球表面熒光標記物，該方法能檢測蛋白或核酸，特別適用于流行病學調查、臨床診斷及蛋白組學的研究。一項研究通過液相芯片技術監測肺結核患者治療過程中血清IP-10、IL-17A水平的動態變化，發現患者血清IP-10、IL-17A水平隨著治療時間延長而下降，提示液相芯片技術可能可以作為抗結核治療療效的監測方法[24]。

4 分子生物學

4.1PCR PCR技術是以體外擴增技術檢測標本中結核菌特異性的DNA片段，該方法具有快速、特異、敏感等特點，但檢查技術質量對結果影響較大[25]。有學者通過運用PCR技術研究發現髓源性抑制細胞(MDSCs)具有顯著的抑制T細胞反應的能力，在調節結核病免疫反應中起重要作用，在抗結核治療有效后該類細胞有減少趨勢，提示這些細胞可作為監測抗結核治療療效的一個潛在的生物標志物[26]。

4.2實時熒光定量PCR(RT-PCR) RT-PCR是一種基于PCR技術的核酸定量技術。繆家文等[27]建立檢測人顆粒溶素(GNLY)mRNA含量的實時熒光定量PCR的方法，并測定肺結核病患者外周血單個核細胞(PBMC)中顆粒溶素(GNLY)的基因表達水平，發現肺結核患者PBMC GNLY基因表達水平顯著低于對照組，治療前菌陽組PBMC GNLY基因表達水平顯著低于菌陰組，治療后菌陽組PBMC GNLY基因表達水平較治療前顯著升高，提示CNLY基因表達水平可作為肺結核治療的療效觀察及預后判斷的一個新的實驗室指標。

4.3蛋白芯片技術 蛋白芯片技術具有簡便、快速、準確，敏感度較高、特異度強和檢測成本低等優點，是臨床輔助診斷結核病的有效方法。結核分支桿菌蛋白芯片技術同時用結核菌脂阿拉伯甘露糖(LAM)、蛋白16×103和38×103等3種抗原進行檢測,提高了檢測的陽性率。有研究發現,當治療有效或感染被控制時，抗體水平會隨之下降，反映出結核蛋白芯片能動態監測這3種抗體水平，故結核蛋白芯片能動態監測抗結核病治療療效[28-29]。Deng等[30]利用釀酒酵母系統可溶表達結核分支桿菌蛋白并點制成蛋白芯片，利用芯片尋找血清中的生物標記物以評估治療效果。不足之處是敏感度、特異度尚不夠高。目前對蛋白芯片技術對結核病療效的監測尚缺乏系統研究。

5 展 望

當痰涂片檢測抗酸染色陰性時，臨床很難對肺結核進行快速的明確診斷。目前結核病的療效監測技術方法和指標很多，除文中列舉以外，尚有其他許多新型手段在臨床和實驗中探討應用。每種技術方法和指標均有其各自的優缺點，但目前仍缺乏方便、快捷、有效、價廉的判斷方法和指標，主要依賴多指標檢測及臨床綜合評估。如何更好、更快地實時監測結核病情變化與治療效果，為合理用藥和規范治療提供科學依據，及早發現耐藥、及時更換治療方案、減少經濟浪費、減輕不必要用藥對患者的損害、提高服藥依從性、選擇最佳治療方案、改善結核預后、提高治愈率成為當前研究的方向。通過侵入性操作提高樣本的取樣有效率，應用靈敏、特異、快速的免疫學及分子生物學檢測，可能具有良好的研究前景。

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R516

A

1671-8348(2017)31-4441-03

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.31.044

重慶市衛生和計劃生育委員會醫學科研重點項目(2013-1-038)。

陳云坤(1992-)，在讀碩士，主要從事呼吸系統疾病的診療工作。△

，E-mail:fykme@163.com。

2017-04-11

2017-07-13)