硅酮凝膠對小型豬瘢痕模型血管內皮生長因子表達的影響

黎丁菱+高彥晨+農曉琳

[摘要]目的 研究硅酮凝膠對小型豬瘢痕模型中血管內皮生長因子（VEGF）的影響，探討醫用硅酮凝膠的作用機制。方法 于2015年7～9月構建小型豬豬背瘢痕模型，隨機分為空白對照組和硅酮凝膠組。硅酮凝膠組在術后28 d外用醫用硅酮凝膠噴霧劑，空白對照組不作處理。術后56 d處死動物，切取豬背瘢痕，采用免疫組化的方法觀察瘢痕中VEGF的變化情況。結果 硅酮凝膠組的瘢痕增生較空白對照組顯著減輕。硅酮凝膠組的VEGF平均光密度值為0.034±0.081，顯著低于空白對照組的0.110±0.014，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 硅酮凝膠可能通過下調VEGF而減輕瘢痕的增生。

[關鍵詞]瘢痕；硅酮凝膠；血管內皮生長因子；動物模型

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）01（c）-0123-03

[Abstract]Objective To study the influence of Silicone Gel on the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） in scar model on the back of miniature pig and to explore the mechanism of action of medical Silicone Gel.Methods From July to September in 2015，the minipig back scar model was constructed and were randomly divided into the control group and the Silicone Gel group.The Silicone Gel group was given Medical Silicone Gel Spray after operation for 28 days，the control group was not treated.The animals were sacrificed after operation at 56 days，and the scar of pig back was removed.The changes of VEGF was observed by immunohistochemistry.Results Scar hyperplasia in the Silicone Gel group was significantly reduced，compared with the blank control group.The average optical density of VEGF in the Silicone Gel group was 0.034±0.081，which was lower than 0.110±0.014 in the the control group，with significant difference （P<0.05）.Conclusion Silicone Gel may reduce scar hyperplasia by down-regulation of VEGF.

[Key words]Scar；Silicone Gel；Vascular endothelial growth factor；Animal model

皮膚病理性瘢痕是創傷愈合過程中形成的一種皮膚纖維組織增生性疾病，包括增生性瘢痕（hypertrophic scar）和瘢痕疙瘩（keloid）。增生性瘢痕是臨床上常見疾病，目前防治增生性瘢痕的方法很多，例如手術治療、藥物治療和放射治療等，但治療效果并不十分理想，停止治療后容易復發[1]。在分析病理性瘢痕發生機制的因素中，血管因素在瘢痕形成過程中的作用越來越受到重視。初步的研究顯示，瘢痕的發生、發展、轉歸及預后與瘢痕組織的微血管形成及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等細胞因子過度表達緊密相關[2]。VEGF是目前已知的最強的促血管因子，具有促進細胞增殖、促進血管支持物生成等功能，且在病理性瘢痕中呈高度表達[3-4]。本研究通過建立小型豬增生性瘢痕模型，探討硅酮凝膠噴霧劑對增生性瘢痕的作用機制及對VEGF表達的影響，為醫用硅酮凝膠的應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1實驗對象

健康雌性巴馬小型豬2只（廣西大學動物科學院提供，許可證號：SCXK桂2013-003），清潔級，4月齡，體重為12.0～12.3 kg。動物喂養于通風、干燥的環境中，單只分籠人工混合飼料喂養，適應性飼養7 d。

1.2主要試劑和儀器

醫用硅酮凝膠噴霧劑（上海上大吉申科技開發有限公司，產品標準號：YZB/滬 1761-64-2012），兔抗VEGF多克隆一抗（北京博奧森生物技術有限公司），羊抗兔抗鼠通用型二抗、免疫組化試劑盒及DAB酶底物顯示試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3實驗方法

1.3.1豬背瘢痕模型實驗 術前12 h禁食，8 h禁飲，使用速眠新Ⅱ0.2 ml/kg肌內注射，待動物四肢無力后使用3%戊巴比妥鈉溶液0.3 ml/kg肌內注射。動物取俯臥位，背部去毛，局部皮膚碘酒、乙醇消毒，鋪巾。在小型豬背部建立豬背瘢痕模型的方法參照相關文獻[5]，分別于豬背兩側建立6塊瘢痕創面，損傷面積約為3 cm×3 cm，傷口止血后暴露不做其他處理。術后分圈喂養，自由進食，觀察創面愈合情況，待創面自然表皮化瘢痕愈合。于術后第28天，將動物隨機分為空白對照組（不加任何處理）和硅酮凝膠組，每組1只小型豬，12個創面。于創面制備術后28 d，硅酮凝膠組在豬背瘢痕處噴涂硅酮凝膠，早晚各1次，連續用藥，用藥期間實驗動物無舔食藥物等現象。小型豬連續用藥28 d后（即術后第56天），處死動物并切取小型豬背部瘢痕標本，標本取自瘢痕組織中央及周圍交界區。

1.3.2瘢痕組織中VEGF表達的檢測（SP法） 標本在4%多聚甲醛中固定48 h后，脫水、石蠟包埋、切片，厚5 μm。石蠟切片脫蠟復水，蒸餾水沖洗，于pH為6.0的枸櫞酸中行抗原熱修復，PBS沖洗，3%過氧化氫孵育10 min，PBS沖洗，10%山羊血清封閉10 min，傾去加入一抗（1∶100），4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，生物素標記的二抗工作液37℃孵育15 min，PBS沖洗3次，辣根過氧化物酶標記37℃溫箱孵育15 min，PBS沖洗3次，DAB染色，顯微鏡觀察后徹底沖洗，蘇木素復染返藍，中性樹酯常規封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，操作同上述步驟。將每張切片在光鏡下隨機選取5個高倍視野（×400），采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統以同一模式計算表達的光密度值作為其表達強度進行分析。

1.4統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行處理，計量資料以x±s表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1大體觀察

豬背瘢痕術后14 d，創面已完全結痂；術后28 d，兩組增生性瘢痕形成明顯，較周邊正常皮膚凸起，色暗紅，質地堅硬；用藥28 d后，空白對照組與術后28 d比較差異無明顯變化；與空白對照組相比，硅酮凝膠組瘢痕體積減小，表面趨于平坦，質地變軟，顏色與周邊正常皮膚相近。

2.2兩組瘢痕組織中VEGF蛋白的表達

VEGF的陽性表達主要定位于瘢痕組織的成纖維細胞、血管內皮細胞及炎性細胞的細胞質，呈棕黃色或黃色。光鏡下可見硅酮凝膠組中VEGF蛋白染色后呈陽性表達，與空白對照組相比，VEGF蛋白表達水平明顯降低（圖1），而PBS代替一抗的陰性組中VEGF蛋白未見有陽性表達。采用IPP軟件分析VEGF蛋白的平均光密度值，結果顯示，硅酮凝膠組的VEGF平均光密度值為0.034±0.081，顯著低于空白對照組的0.110±0.014，差異有統計學意義（P<0.05）。

3討論

病理性瘢痕是皮膚創傷愈合過程中組織修復的過度增殖，是細胞外基質過度合成并分泌的纖維化疾病，可發生于身體的任何組織，是創傷愈合后的產物，其發病機制尚未完全明確[6-7]。增生性瘢痕不但影響患者的容貌，而且產生瘢痕攣縮可導致不同程度的功能障礙，給患者帶來巨大痛苦。Clark等[8]發現增生性瘢痕組織中微血管密度明顯高于萎縮性瘢痕和正常皮膚，并推測瘢痕的形成可能有一定的血管依賴性。局部血管增生在病理性瘢痕的生長及復發過程中極可能發揮著關鍵的作用，因此可以假設抑制瘢痕及其周圍正常皮膚的血管生成將有助于抑制瘢痕生長及復發。VEGF是血管內皮細胞的強效優勢分裂原，具有強烈的促血管生成作用，可促進血管內皮細胞增殖、分化，增加局部組織微血管的通透性[9]，改變細胞外基質的成分[10]。增生性瘢痕中VEGF主要由成纖維細胞、角質形成細胞分泌，其能促進多種組織的血管新生和血管內皮細胞的增殖、遷移，從而促進病理性瘢痕的形成，抑制其表達可以減少增生性瘢痕的血管生成并減少膠原合成[11]。

硅酮凝膠噴霧劑是目前臨床應用于防治瘢痕的藥物之一，為硅酮制劑的氣霧型。臨床上主要用于燒傷、創傷及外科手術后預防增生性瘢痕的形成和輔助治療，對潛在瘢痕的增殖及創面部位的疼痛、痛癢等癥狀具有良好的效果[12-13]；其對增生性瘢痕效果較好，但作用機制仍未十分清楚[14]。本實驗采用小型豬作為實驗動物，其皮膚表皮形態學，甚至表皮細胞的更新時間都和人類的皮膚非常相近[15]，且巴馬小型豬是廣西地區獨特的小型豬種，體型小，操作容易，遺傳穩定，個體差異小，是一種理想的實驗動物[16]。本實驗通過構建小型豬豬背瘢痕模型，外用硅酮凝膠噴霧劑，從中觀察其療效，結果顯示，在大體形態方面，硅酮凝膠組較空白對照組瘢痕面積減小，質地變軟；從免疫組織化學的結果可以看出，在硅酮凝膠組中VEGF表達水平顯著降低，提示硅酮凝膠能抑制豬背瘢痕模型組織中VEGF的表達。

綜上所述，外用硅酮凝膠噴霧劑可以引起豬背瘢痕組織中VEGF表達水平下降，其可能通過改變瘢痕組織局部VEGF的表達水平以抑制瘢痕微血管的增生，減少瘢痕營養供給，減少膠原沉積，進而達到抑制瘢痕增生的目的，但有待進一步研究以得到更多的證據加以驗證。

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（收稿日期：2016-10-31 本文編輯：祁海文）