胃癌患者組織p-mTOR的陽性表達與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性

王靜，王亞明，霍雙，吳士茜，孫穎，袁艷龍，王杰，田云霄，張桂東，劉博

(邯鄲市中心醫(yī)院病理科1、普外科2、科教科3、泌尿外科4、急診外科5，河北 邯鄲056001)

胃癌患者組織p-mTOR的陽性表達與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性

王靜1，王亞明2，霍雙3，吳士茜1，孫穎1，袁艷龍1，王杰4，田云霄1，張桂東2，劉博5

(邯鄲市中心醫(yī)院病理科1、普外科2、科教科3、泌尿外科4、急診外科5，河北 邯鄲056001)

目的 探討胃癌患者組織磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的陽性表達與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。方法 于2013年1月至12月對邯鄲市中心醫(yī)院收治的89例胃癌患者采用免疫組化法檢測胃組織標本中p-mTOR的表達，分析其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、組織分化程度和病理分期的相關(guān)性，并按p-mTOR的不同表達情況比較患者的預(yù)后。結(jié)果p-mTOR陽性率為77.53%(69/89)，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者p-mTOR陽性率為90.20%，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的60.53%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；Spearman等級相關(guān)分析顯示，p-mTOR的陽性表達與浸潤深度、組織分化及腫瘤分期均呈正相關(guān)(P＜0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.65、0.69和0.64。p-mTOR低表達組的疾病無進展中位生存期為23.5個月，顯著長于高表達組的12.8個月，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論p-mTOR在胃癌患者體內(nèi)高表達，檢測p-mTOR的表達有利于患者的預(yù)后評估。

胃癌；磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；免疫組化；預(yù)后；相關(guān)性

胃癌(gastric cancer，GC)是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，作為全球常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于肺癌、乳腺癌與腸癌之后，且在惡性腫瘤死因順位中列第二位。我國是胃癌高發(fā)地區(qū)，每年新發(fā)和死亡病例分別約為40萬和35萬，嚴重威脅生命健康[1]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞信號傳導(dǎo)機制對腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、逃避凋亡起著重要的調(diào)控作用[2]。磷酸化雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR)相關(guān)信號通路的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，調(diào)控血管內(nèi)皮細胞增殖及蛋白質(zhì)合成是其主要的生物學(xué)功能。p-mTOR在促進腫瘤細胞生長、新生血管的生成、浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要影響[3]，在多種腫瘤細胞中高表達，并且與腫瘤分級呈現(xiàn)明顯相關(guān)性[4-5]。目前，p-mTOR與胃癌的關(guān)系報道很少，本研究采用免疫組化方法分析p-mTOR在胃癌患者胃癌組織中的表達，探討其表達水平與胃癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性，為今后胃病患者的個體化治療和預(yù)后評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2013年12月在本院經(jīng)胃鏡病理證實為胃部惡性腫瘤、擬行胃癌根治切除術(shù)的胃癌患者89例，其中男性54例，女性35例；年齡38～72歲，平均(58.52±12.32)歲。參照1997年UICC臨床TNM分期標準：Ⅰ期12例，Ⅱ期24例，Ⅲ期26例，Ⅳ期27例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例；組織學(xué)類型：高分化腺癌25例、中分化腺癌28例、低分化腺癌36例；浸潤黏膜及黏膜下層28例，浸潤肌層30例，浸染漿膜層及漿膜層以上31例。另隨機抽取25例胃癌切緣黏膜作為正常對照組(均經(jīng)病理組織學(xué)證實)。

1.2 納入與排除標準 納入的所有胃癌病例均為初治患者，入選前均沒有接受放療、化療或者激素及非甾體類藥物治療；病理學(xué)診斷明確；均在本院接受規(guī)范化根治性胃癌切除治療，有完整的病歷資料。排除術(shù)后病理提示為胃肉瘤、胃淋巴瘤等其他組織來源惡性腫瘤、有出血/血栓性疾病或惡性腫瘤已出現(xiàn)骨髓轉(zhuǎn)移、近3個月內(nèi)使用腎上腺皮質(zhì)激素、雌激素、阿司匹林等影響凝血功能藥物者、一般情況差、合并嚴重心腦血管疾病或有嚴重肝、腎臟器功能障礙者、近3個月內(nèi)曾接受手術(shù)治療者。

1.3 主要試劑 兔抗人p-mTOR多克隆抗體購自美國Bioworld生物公司，免疫組織化學(xué)SP試劑盒、DAB顯色試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.4 研究方法 取手術(shù)切除胃癌標本，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋組織標本，切成厚度為4 μm的切片，60℃過夜，經(jīng)過二甲苯、乙醇脫蠟，使用蒸餾水及磷酸鹽緩沖液(PBS)各沖洗3次，采用3%甲醇雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)和血清封閉后，添加一抗、二抗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染后封片。用PBS代替一抗作為陰性對照，并用已知的p-mTOR蛋白陽性的胃癌切片為陽性對照。

1.5 結(jié)果判斷p-mTOR蛋白在細胞質(zhì)中表達，陽性染色為呈黃色顆粒沉著者。計算每高倍視野中陽性染色細胞的百分率，0分為無陽性細胞者，1分為陽性細胞＜10%者；2分為陽性細胞在11%～50%者；3分為陽性細胞在51%～80%者；4分為陽性細胞＞80%者。并按照染色深度分為：0分為細胞不顯色；1分為淺棕黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。以兩者乘積為最后得分：(-)為0分；(+)為1～4分；(++)為5～8分；(+++)為9～12分。

1.6 術(shù)后隨訪 患者術(shù)后均順利出院。出院后采用電話或門診復(fù)查等方式進行隨訪，隨訪間隔為3個月，隨訪起始時間為術(shù)后病理確診日期，隨訪截止時間為2015年12月。總生存期是指從確診時間至疾病進展或隨訪截止的時間。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用Pearson χ2檢驗或Fisher's精確概率檢驗，相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析，使用Log-rank檢驗比較組間的無進展生存情況。檢驗水準α取值為0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的p-mTOR的陽性等級比較89例胃癌患者中，共69例患者p-mTOR表達陽性，陽性率為77.53%，而25例正常胃黏膜中，p-mTOR陽性4例，陽性率為16%，兩組受檢者的p-mTOR表達陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=34.15，P＜0.05)，見表1。

表1 兩組受檢者的p-mTOR陽性等級比較[例（%）]

2.2 p-mTOR的陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 胃癌組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的51例患者中，p-mTOR陽性有46例，陽性率為90.20%；而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的38例患者中，p-mTOR陽性有23例，陽性率為60.53%。兩組p-mTOR的表達等級情況見表2，兩組p-mTOR不同等級構(gòu)成比的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=26.22，P＜0.05)。

表2 有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組的p-mTOR陽性等級情況[例（%）]

2.3 p-mTOR的陽性表達與浸潤深度的關(guān)系 癌組織浸潤在黏膜及黏膜下層p-mTOR陽性有13例，陽性率為46.42%；癌組織浸潤肌層者p-mTOR陽性26例，陽性率為86.67%；癌組織浸潤漿膜層及漿膜層以上p-mTOR陽性30例，陽性率為96.77%。Spearman等級相關(guān)分析顯示，p-mTOR的陽性表達與浸潤深度呈較強的正相關(guān)(r=0.65，P＜0.01)，見表3。

表3 p-mTOR的陽性表達與浸潤深度的相關(guān)性(例)

2.4 p-mTOR的陽性表達與組織類型分化的關(guān)系 高分化組p-mTOR陽性有12例，陽性率為48.00%；中分化組p-mTOR陽性23例，陽性率為82.14%；低分化組p-mTOR陽性34例，陽性率為94.44%。Spearman等級相關(guān)分析顯示p-mTOR的陽性表達與組織分化程度呈較強的正相關(guān)(r=0.69，P＜0.01)，見表4。

表4 p-mTOR的陽性表達與組織分化程度的相關(guān)性（例）

2.5 p-mTOR的陽性表達與腫瘤病理分期的關(guān)系 Ⅰ期組p-mTOR陽性有5例，陽性率為41.67%；Ⅱ期組p-mTOR陽性18例，陽性率為75.00%；Ⅲ期組p-mTOR陽性21例，陽性率為80.77%；Ⅳ期組p-mTOR陽性25例，陽性率為92.59%。Spearman等級相關(guān)分析顯示p-mTOR的陽性表達與腫瘤病理分期呈較強正相關(guān)(r=0.64，P＜0.01)，見表5。

表5 p-mTOR的陽性表達與腫瘤分期的相關(guān)性（例）

2.6 p-mTOR的表達與胃癌預(yù)后的關(guān)系 將p-mTOR按評分劃為低表達組(評分為4分及以下)34例和高表達組(5分以上)55例，低表達組與高表達組的疾病無進展中位生存期分別為23.5個月和12.8個月，兩組生存率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rank χ2= 28.72，P＜0.01)。

3 討論

胃癌細胞自身具有的下調(diào)細胞間相互粘附性、促進微血管增生、降解周圍基質(zhì)等功能是促進癌細胞增生、侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)基礎(chǔ)，也是影響胃癌臨床療效和預(yù)后的主要原因[6]。p-mTOR是蘇氨酸激酶/絲氨酸的一種，它位于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/鼠類胸腺瘤病毒致癌基因同源物(Akt)/mTOR信號通路的下游，它一方面可以接受細胞外生長因子、細胞外營養(yǎng)素的等來自上游的信息刺激；另一方面，mTOR將信息進一步傳遞給下游，從而對細胞周期的進展發(fā)揮影響，導(dǎo)致細胞出現(xiàn)分化。PI3K/Akt途徑在腫瘤中被激活后可引起細胞周期調(diào)節(jié)失控，從而引發(fā)細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤進展。這種編碼mTOR信號通路相關(guān)蛋白的基因突變存在于多種腫瘤中，蛋白的異常表達能夠使mTOR通路激活過度。PI3K/Akt/mTOR信號通路失調(diào)與乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系，mTOR是腫瘤發(fā)生過程中的一個決定性因子，通過PI3K/Akt細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活并磷酸化后形成p-mTOR。p-mTOR可以降低細胞凋亡、加速細胞周期、促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。對p-mTOR的相關(guān)分子作用機制研究顯示，p-mTOR可以通過對其下游分子4EBP1的激活，抑制不依賴p53的細胞凋亡[7-8]，促進血管內(nèi)皮生長因子的表達，使腫瘤細胞與新生血管生成加速[9-10]，并增強對抗腫瘤藥物的抵抗[11]，從而促進腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移[12-14]。陳業(yè)剛等[5]通過對p-mTOR與膀胱癌的關(guān)系進行研究，發(fā)現(xiàn)p-mTOR能促使膀胱上皮增生活躍，且p-mTOR是膀胱癌復(fù)發(fā)的獨立危險因素。可見，p-mTOR在人體許多癌癥細胞中表達水平高，對腫瘤細胞的生長、浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移等具有重要影響。通過對p-mTOR的檢測能夠反映mTOR通路的激活狀態(tài)，并成為腫瘤治療中的一個重要靶點。

p-mTOR與胃癌的關(guān)系的研究較少。有研究表明，p-mTOR在胃癌的發(fā)展中呈現(xiàn)過度表達。本研究顯示p-mTOR在胃癌中的陽性率為77.53%，高于徐大志等[15]的研究，而與Lang等[16]的研究比較接近。本研究顯示，p-mTOR在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，與同類研究結(jié)果一致[15]。并且p-mTOR陽性表達情況與癌組織浸潤程度、組織分化程度及病理分期呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明癌組織浸潤程度越深、組織分化程度越差、病理分期越高，p-mTOR陽性表達率越高，許星宇等[17]的研究也證明了類似的結(jié)論。推測p-mTOR的陽性表達可能從上述幾方面影響胃癌患者的預(yù)后。本研究還發(fā)現(xiàn)，p-mTOR低表達組的疾病無進展中位生存期顯著高于p-mTOR高表達組，兩組生存率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，p-mTOR的激活在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要的作用，p-mTOR的測定對于胃癌的治療和預(yù)后判斷可以提供積極的指導(dǎo)作用。

綜上所述，p-mTOR在胃癌患者體內(nèi)高表達，對于胃癌的發(fā)生、侵襲、進展起著較重要的作用。檢測p-mTOR可為患者的預(yù)后評估提供參考意義，p-mTOR可能成為預(yù)測胃癌進展的新型分子標志物，并且有望成為胃癌靶向治療的有效靶點。

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Correlation of positive expression of p-mTOR with clinicopathological factors and prognosis in gastric cancerpatients.

WANG Jing1,WANG Ya-ming2,HUO Shuang3,WU Shi-xi1,SUN Ying1,YUAN Yan-long1,WANG Jie4,TIAN Yun-xiao1,ZHANG Gui-dong2,LIU Bo5.Department of Pathology1,Department of General Surgery2,Department of Science and Education3,Department of Urinary Surgery4,Department of Emergency Surgery5,Handan Municipal Central Hospital,Handan 056001,Hebei,CHINA

ObjectiveTo analyze the correlation of positive expression of phosphorylated mammalian target of raphmycin(p-mTOR)with clinicopathological factors and prognosis in gastric cancer patients.MethodsThe expression of p-mTOR of stomach tissue specimens from 89 gastric cancer patients in Handan Municipal Central Hospital from Jan.2013 to Dec.2013 were detected by immunohistochemistry method,and its correlation with lymphatic metastasis, depth of invasion,degree of differentiation and pathological stage were analyzed.The relationship of p-mTOR with prognosis of patients was assessed according to the expression level of p-mTOR.ResultsThe positive rate of p-mTOR was 77.53%(69/89).The positive rate of p-mTOR in patients with lymphatic metastasis was 90.20%,higher than that of patients without lymphatic metastasis(60.53%),and difference was statistically significant(P＜0.05).The Spearman rank correlation showed that positive expression of p-mTOR had positive correlation with depth of invasion,degree of differentiation and pathological stage(all P＜0.01),with correlation coefficient of 0.65,0.69,and 0.64 respectively.The median progression free survival in group of low p-mTOR expressing was 23.5 months,longer than that of group of high p-mTOR expressing which was 12.8 months,and the difference was statistically significant(P＜0.01).ConclusionThere is high expression of p-mTOR in gastric cancer patients,and the detection of p-mTOR is in favor of assessment of prognosis.

Gastric cancer;p-mTOR;Immunohistochemistry;Prognosis;Correlation

R735.2

A

1003—6350（2017）02—0188—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.02.006

2016-06-08)

王亞明。E-mail：wangjing1133wj@sina.com