樺木酸對人肝癌HepG2腫瘤干細胞增殖的影響

陳飛宇 李澎 甘加寬 張安娜 任鈞國 劉建勛

摘要：目的 觀察樺木酸（betulinic acid，BA）對人肝癌HepG2腫瘤干細胞增殖的影響，并從細胞生長周期和細胞凋亡兩方面初步探討其抗肝癌的作用機制。方法 體外培養人肝癌HepG2腫瘤干細胞并證明其自我更新能力。CCK-8法檢測40、20、10、5、2.5、1.25 μmol/L BA作用人肝癌HepG2腫瘤干細胞24、48 h的細胞活力；40、20、10、5 μmol/L BA作用人肝癌HepG2腫瘤干細胞48 h，流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡率。結果 BA對人肝癌HepG2腫瘤干細胞增殖有明顯的抑制作用，并呈一定的量-效關系；BA能明顯影響腫瘤干細胞周期，誘導腫瘤干細胞凋亡，40 μmol/L BA明顯阻滯細胞周期于S期，且細胞凋亡率達到10.86%。結論 BA對人肝癌HepG2腫瘤干細胞增殖具有明顯的抑制作用，其可能通過影響腫瘤干細胞周期及誘導腫瘤干細胞凋亡而發揮作用。

關鍵詞：樺木酸；石見穿；人肝癌HepG2細胞；腫瘤干細胞；細胞凋亡

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.016

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）02-0060-05

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是緊隨肺癌、胃癌、食管癌之后的發病率和死亡率較高的惡性腫瘤。最新數據顯示，肝癌在60歲以下的男性中屬發病率最高和死亡率最高的癌癥[1]。由于肝癌的高復發、高轉移率和化療抗藥性，治療效果并不樂觀。近年來，越來越多的學者認為徹底治愈腫瘤的有效療

法除針對腫瘤組織中的大部分腫瘤細胞，更重要的是靶向其中的腫瘤干細胞[2-3]。腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）是腫瘤組織中存在的極小部分細胞，通常處于靜止狀態，當受到細胞因子等影響時會導致腫瘤的發生、轉移和復發，這均源于CSC擁有很強的自我更新及增殖分化的能力。我們前期以S180荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠為模型進行體內篩選，發現中藥石見穿具有較好的抗腫瘤作用[4-5]，進一步對石見穿進行化學成分分析，發現樺木酸（betulinic acid，BA）為石見穿發揮抗腫瘤作用的主要有效成分之一。因此，本實驗觀察BA對人肝癌HepG2腫瘤干細胞增殖的影響，并從細胞生長周期和細胞凋亡兩方面初步探討其抗肝癌的作用機制。

1 實驗材料

1.1 細胞株

人肝癌HepG2細胞株，中國科學院細胞庫，目錄號TCHu72。

1.2 主要試劑與儀器

BA（Sigma），5-氟尿嘧啶（5-FU，海普藥業），胎牛血清（Gibco），DMEM/F12+GlutaMAX-I培養基（Gibco），肝素（Sigma），B27神經細胞生長添加劑（Gibco），堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，Acro Biosystem），成纖維細胞生長因子（EGF，Acro Biosystem），BSA（Sigma），青鏈霉素混合液（Solarbio），磷酸鹽緩沖液（HyClone），0.25%胰蛋白酶、DMSO（MP Biomedicals），無酚紅DMEM（Macgene），CCK-8試劑盒（Dojindo），細胞周期試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），FITC Annexin V凋亡試劑盒（BD）。MCO175型CO2培養箱（德國Galaxy公司），TH-200型顯微鏡（日本Olympus公司），Stnergy-4型酶標儀（美國Biotek公司），IEC-CL31R型離心機（美國Thermo Fisher公司），NAVISO型流式細胞儀（美國Bechman Coulter公司），JCSO344型高壓蒸汽滅菌鍋（日本Hirayama公司）。

2 實驗方法

2.1 人肝癌HepG2腫瘤干細胞培養

參考文獻[6-7]進行無血清培養基的制備及人肝癌HepG2腫瘤球干細胞的培養和傳代。

2.1.1 無血清干細胞培養基制備 在DMEM/F12培養基中添加20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、2% B27、4 μg/mL肝素、0.4%BSA、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。

2.1.2 細胞培養 正常培養人肝癌HepG2細胞，胰酶消化無血清培養基重懸，計數，稀釋為2×103/mL，2.5 mL/孔，則5×103/孔接種于低吸附6孔板。置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。1 d后可觀察到有懸浮細胞球形成。每3 d半量換液。

2.1.3 細胞傳代 當細胞形成懸浮細胞球（約6 d），進行傳代培養。將含細胞培養液懸浮細胞收集于離心管中，800 r/min離心5 min，1 mL胰酶替代物TrypLE Express消化，加胰酶時吹打幾下稍等片刻，即可加PBS稀釋，離心洗滌2～3次后無血清培養基重懸，再取適量加無血清培養基稀釋培養。

2.2 分組和給藥

正常組：DMEM培養基；對照組：DMEM培養基（含0.01%DMSO）；5-FU組：10 μg/mL 5-FU；BA各劑量組：DMSO為溶劑制備40 mmol/L BA，實驗過程中以1000倍培養液稀釋為40 μmol/L，同時等比對倍稀釋分別得到濃度為20、10、5、2.5、1.25 μmol/L的BA培養液。

2.3 細胞自我更新能力驗證

收集腫瘤干細胞，無血清培養基稀釋為每毫升500個。在低吸附96孔板上每孔加入150 μL無血清培養基，并將稀釋好的腫瘤干細胞2 μL/孔加入96孔板。鏡下觀察，選取有且僅有1個細胞的孔每日拍照記錄。

2.4 細胞增殖檢測

將對數生長期的人肝癌HepG2腫瘤干細胞制成1×108/L的細胞懸液，接種于低吸附96孔板，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，24 h后更換不含細胞因子的DMEM/F12培養基同步化使細胞處于G0期，24 h后分組處理，分別培養于BA濃度為40、20、10、5 μmol/L的無血清培養基中，每組設5個復孔，繼續培養。48 h后棄上清液，PBS沖洗1遍后每孔加入配制好的CCK-8試劑120 μL，培養箱中繼續孵育2 h。將顯色完成的液體轉移至正常96孔板中，于酶標儀波長490 nm處檢測吸光度（OD）值。計算細胞抑制率。細胞抑制率（%）=（對照孔OD值-給藥孔OD值）÷對照孔OD值×100%。

2.5 細胞周期檢測

將人肝癌HepG2腫瘤干細胞用胰酶替代物消化，無血清培養液重懸，計數，稀釋為5×103/mL，3 mL/孔接種于6孔板中。待細胞穩定成球，將各孔懸浮細胞培養液轉移至離心管中，1500 r/min離心5～10 min，吸棄原培養液，PBS沖洗1遍，加入無血清培養基進行同步化。24 h后按上述方法離心，吸棄無血清培養基，按照分組給藥。藥物作用48 h后，將各組細胞培養液收集到離心管中。1000×g離心3～5 min，沉淀細胞。吸除上清，加入約1 mL冰浴預冷的PBS重懸細胞，并轉移至1.5 mL離心管中。再次離心沉淀細胞，棄上清，加入1 mL冰浴預冷的70%乙醇，輕輕吹打均勻，4 ℃固定，過夜。離心，沉淀細胞，棄上清液，用1 mL冰浴PBS沖洗1遍。每管細胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細胞，37 ℃避光溫浴30 min，24 h內流式細胞儀檢測。

2.6 細胞凋亡檢測

將人肝癌HepG2腫瘤干細胞用胰酶替代物消化，無血清培養液重懸，計數，稀釋為5×103/mL，3 mL/孔接種于6孔板中。待細胞穩定成球，將各孔懸浮細胞培養液轉移至離心管中，1500 r/min離心5～10 min，吸棄原培養液，PBS沖洗1遍，加入無血清培養基進行同步化。24 h后按上述方法離心，吸棄無血清培養基，按照分組給藥。藥物作用48 h后，將各組細胞培養液收集到離心管中，1500 r/min離心5～10 min，吸棄上清液，加入1 mL冰浴預冷的PBS沖洗細胞2次。用1×Binding Buffer緩沖液制成1×106/mL的懸液，吸取上述懸液100 μL至Falcon試管，加入FITC Annexin V和碘化丙啶染料，輕輕渦旋，室溫避光放置15 min后，分別加入1×Binding Buffer緩沖液400 μL，1 h內流式細胞儀檢測，嚴格按照凋亡試劑盒說明書進行操作。

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，各組數據通過正態性分布檢驗和方差齊性檢驗后，組間比較采用方差分析或者非參數檢驗法。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 人肝癌HepG2腫瘤干細胞自我更新能力

選取有且僅有1個細胞的孔連續觀察，第6日可看到細胞增殖，第8日細胞增殖數目明顯增多。結果見圖1。

5 討論

BA是一種五環三萜類化合物，最早發現于樺木屬植物白樺的樹皮中。研究發現，BA具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒等多種藥理活性[8]，其中抗腫瘤是該化學成分的主要藥理作用。20世紀90年代，科學家對2500種植物提取物進行抗癌活性實驗，發現BA對人黑色素瘤具有選擇性的抗癌活性[9]，隨后在乳腺癌、腦癌、前列腺癌、結腸癌、白血病等常見腫瘤中均驗證了BA的抗腫瘤作用[10]。與BA對多種腫瘤具有潛在毒性不同的是，非腫瘤細胞及正常組織對BA有相對抵抗性[11]。 目前關于BA的抗腫瘤作用及機制已進行了許多研究，但有關該化學成分對肝癌的作用研究至今還未見報道。因此，本實驗觀察對無血清培養的人肝癌HepG2腫瘤干細胞的自我更新能力進行了驗證。其次，CCK-8實驗結果顯示，BA作用48 h后，對人肝癌HepG2腫瘤干細胞增殖活力抑制作用增強，并呈明顯的量-效關系。我們前期研究發現，BA對HepG2細胞的IC50為19.68 μmol/L，而該實驗中BA作用于HepG2干細胞48 h的IC50為18.30 μmol/L，表明BA在抑制HepG2干細胞與HepG2細胞的增殖活力上效果相似。我們通過流式細胞儀進行細胞周期檢測發現，高濃度BA（40 μmol/L）能抑制HepG2腫瘤干細胞從S期進入G2/M期，將其阻滯于S期，表明高濃度BA通過抑制DNA的合成抑制HepG2細胞的生長。而5-FU則是將HepG2干細胞周期阻滯于G0/G1期來抑制細胞增殖，表明BA與5-FU對HepG2干細胞具有不同的作用途徑，其分子機制有待進一步研究。

細胞凋亡是正常的生理過程，此過程中，細胞膜保持完整，胞內物質不釋放出胞外，不引發胞外組織的炎性反應[12]。有研究表明，BA通過誘導黑色素瘤細胞的凋亡發揮其抗腫瘤作用。蔣孟軍等[13]認為，BA能夠體外抑制胰腺癌細胞的生長并誘導細胞凋亡。Chakraborty B等[14]也發現，BA衍生物是人結腸癌細胞HT-29細胞凋亡的誘導劑。同時，本實驗也發現，BA可明顯誘導HepG2腫瘤干細胞凋亡，且具有明顯的濃度依賴性。40 μmol/L BA作用于HepG2細胞后，其凋亡率可達10.86%，可見BA的抗腫瘤作用與誘導細胞凋亡有密切的關系。

細胞凋亡與細胞周期之間有許多潛在的關系，通常細胞先被阻滯于細胞的某一周期，然后誘導其發生凋亡，目前很多腫瘤化療藥物正是通過細胞周期阻滯來誘導細胞凋亡，從而達到治療腫瘤的目的。蔣孟軍等[13]研究表明，BA將胰腺癌細胞阻滯于G0期來誘導其凋亡。Foo J B等[15]發現，BA作為黃花第倫桃二氯甲烷提取物的主要成分，通過p53/p21通路將乳腺癌MCF-7細胞阻滯于G0/G1期。但本實驗發現，低濃度BA（5～20 μmol/L）幾乎對細胞周期沒有影響，而對HepG2細胞的凋亡率作用顯著，可見BA對HepG2腫瘤干細胞的凋亡與周期阻斷并無特定聯系。高濃度處理的細胞被阻滯于S期，說明BA通過S期阻斷而誘導細胞凋亡，這可能是BA誘導HepG2腫瘤干細胞凋亡作用途徑的一部分，而低濃度BA誘導凋亡的作用方式并未通過細胞周期阻滯實現，這與高濃度BA誘導凋亡的途徑不同。因此，BA誘導HepG2干細胞的細胞凋亡可能是多途徑的復雜過程，BA對人肝癌HepG2腫瘤干細胞的增殖抑制作用仍有待于進一步研究。

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（收稿日期：2016-04-20）

（修回日期：2016-05-05；編輯：華強）