替加環素對鮑曼不動桿菌生物膜影響的研究

呂月賢，金玉芬，于 庭

(吉林大學第二醫院，吉林 長春130041)

*通訊作者

替加環素對鮑曼不動桿菌生物膜影響的研究

呂月賢，金玉芬，于 庭*

(吉林大學第二醫院，吉林 長春130041)

細菌生物膜(bacterial biofilm,BF)是細菌在生長過程中為適應生存環境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一種與浮游細胞(planktoniccell)相對應的生長方式，當細菌受到各種壓力時,如極端的營養缺乏或過剩、抗生素和抗菌劑、氧化、低 pH值等,大量細菌為了對抗不利的環境,通過自身合成的水合多聚物粘附在固體表面,并在胞外聚合物中生長繁殖而形成的細菌群落[1，2]。 多重耐藥鮑曼不動桿菌(Multiple drug resistant Acinetobacter Bauman,MDR-Ab)是一種條件致病菌，普遍存在于自然界和人體，是醫院感染最常見的機會致病菌之一，近年來在臨床分離的致病菌中鮑曼不動桿菌逐年增多。目前臨床上對鮑曼不動桿菌耐藥性關注逐年增加,除了高水平的抗菌素耐藥性， 最近的一些研究表明，某些MDR鮑曼不動桿菌菌株可形成大量生物膜，且這種細菌一旦形成生物膜,就難以清除,導致嚴重的臨床問題以及宿主免疫系統缺失[3-5]。本實驗主要研究亞抑菌濃度替加環素對MDR-Ab菌生物膜的破壞作用，從而為耐藥菌引起的感染性疾病提供了臨床治療的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 替加環素,批號:#B1527011,購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；結晶紫，批號：20141202，購自國藥集團化學試劑有限公司； 0.9%生理鹽水，批號：H13023200,購自石家莊四藥有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB),批號：1361046，購自北京拜爾迪生物技術有限公司。

1.1.2 儀器 24孔和96孔細胞培養板，上海阿拉丁生物科技有限公司；細菌生物膜載體(直徑14 mm細胞爬片)，上海阿拉丁生物科技有限公司；多功能酶標儀,Termo Scientific； 電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠；共聚焦倒置顯微鏡，OLYMPUS。

1.1.3 菌株 收集自吉林大學第二醫院2015年4-12月份臨床微生物室送檢的80份標本(其中同一患者感染部位的相同菌株剔除掉),經法國梅里埃VIKET2全自動微生物分析儀進行菌種鑒定和藥敏檢測鑒定為MDR-Ab菌。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 聯合采用VIKET2全自動微生物分析儀和紙片擴散法對菌株進行藥敏鑒定，結果按美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)抗菌藥物敏感性實驗指南判別，鮑曼不動桿菌對頭孢菌素類(如頭孢他啶或頭孢吡肟)、碳青霉烯類(如亞胺培南)、β-內酰胺酶抑制劑(如頭孢哌酮/舒巴坦)、氟喹諾酮類(如環丙沙星)和氨基糖苷類(如阿米卡星)中的3類或3類以上抗菌藥物耐藥即判別為MDR-Ab菌。

1.2.2 目標菌的復蘇 將保存在EP管中的目標菌于-20℃冰箱中取出，加入1 ml TSB肉湯培養基，振蕩混勻，將目標菌接種至血平板和麥康凱培養皿中，于35±2℃恒溫培養箱中培養24 h。

1.2.3 測定替加環素的最低抑菌濃度(MIC) 采用微量肉湯稀釋法測定替加環素對MDR-Ab菌株的MIC 將復蘇后傳第一代的目標菌稀釋至106CFU/mL,于96孔板15個孔中均加入100 μl MH肉湯,第一個孔中加入100 μl 1024 μg/mL替加環素，參照美國 2012CLSI所制定的標準進行微量肉湯稀釋法倍比稀釋，再在每孔中加入100 μl上述稀釋濃度的目標菌稀釋液,每株菌設置6個復孔，并設置空白對照組 (MH肉湯培養基 100 μl)作為對照。置于培養箱中培養 20 h,記錄實驗結果,以在小孔內完全抑制細菌生長的最低濃度為 MIC。

1.2.4 結晶紫半定量法測定目標菌株生物膜形成水平 目標菌株生物膜的制備 挑取單個菌落的目標菌4-5個接種至TSB肉湯中，35±2℃恒溫培養箱中培養6 h取出，調整菌液濃度為5×105CFU/mL.無菌 24孔板中加入上述濃度的菌液 600 μl，每株菌3個復孔，并設置陰性對照孔,35±2℃ 恒溫培養箱中培養，隔天換液,3 d后在玻片表面形成成熟生物膜。

結晶紫半定量染色法測定生物膜 玻片經0.9% NaCl 漂洗，用 0.1%的結晶紫染色20 min后，用自來水沖洗去除多余的染液，再加入400 μl 95%乙醇洗脫下生物膜上的結晶紫，最后從洗脫液中取出 200 μl至96孔板中，于多功能酶標儀570 nm 波長處測定每株細菌染色后的OD值,每株菌所測OD值得均值為A，陰性對照組所測OD值均值為Ac，比較樣本A與Ac。根據OD值，將菌株生物膜形成能力分為4類：A≤Ac為陰性(-)；Ac4Ac為強陽性(+++)。

1.2.5 替加環素對目標菌生物膜的影響 替加環素破壞成熟生物膜 將0 mg/L(陰性對照組),0.5 mg/L,1 mg/L,2 mg/L四個不同濃度的替加環素作用于已形成成熟生物膜的鮑曼不動桿菌分為a,b，c，d四組，按照1.2.4所述，先于24孔板中形成成熟的生物膜，再在已成膜的孔中加入上述不同濃度的替加環素,35±2℃恒溫培養箱中分別培養48 h、96 h后，分別取出,酶標儀半定量測定生物膜OD值,并記錄數據。

1.2.6 生物膜形態的觀察 觀察不同亞抑菌濃度的替加環素對已經形成成熟生物膜破壞情況 按上述所述方法在24孔板中形成成熟的生物膜,再在有膜的孔中分別加入600 μl上述不同亞抑菌濃度的替加環素,35±2℃恒溫培養箱中分別培養48 h、96 h后，分別取出，共聚焦倒置光學顯微鏡下觀察鮑曼不動桿菌的破膜情況。

1.2.7 數據處理 用SPSS 19.0統計軟件分析數據,采用單因素的方差分析，分析四組不同條件下所測OD值之間是否具有顯著性差異，P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 細菌耐藥表型測定結果

80株鮑曼不動桿菌均為多重耐藥菌,其中有18株菌對復方新諾明、左氧氟沙星敏感,9株菌僅對復方新諾明敏感，其余對5類抗菌藥物全耐藥。

2.2 MIC測定值

替加環素對80株鮑曼不動桿菌的MIC的檢測數據的范圍為0.5-4.0 mg/L，對多次測量所得的MIC測量值取平均值為2 mg/L。

2.3 生物膜半定量測定結果

80株菌中78株有形成生物膜能力(97.5%)，生物膜形成能力弱陽性的菌株有8株(10%)，陽性菌株48株(60%),強陽性的菌株22株(27.5%),見表1。

2.4 替加環素對成熟生物膜的影響

a,b，c，d 4組不同條件下作用于鮑曼不動桿菌生物膜48 h和96 h所測OD值，見表2,3。統計學顯示，各組之間兩兩進行比較,結果顯示無論作用48 h還是96 h,b,c,d與a組之間比較均有顯著性差異(P48 h分別為0.000,0.000,0.006,P96 h均為0.000)，表明亞抑菌濃度下的替加環素具有破壞成熟生物膜的能力，而在b，c，d三組之間進行比較時發現c,d兩組之間沒有顯著性差異(P48 h=0.094,P96 h=0.063)，b,c之間存在差異(P48 h=0.422,P96 h=0.378)，b,d之間存在顯著性差異(P48 h=0.001,P96 h=0.000)。即2 mg/L和1mg/L濃度的替加環素破壞生物膜的能力沒有差異，但均與0.5 mg/L濃度的替加環素破壞生物膜的能力有差異,且比其破壞能力強,統計結果見表4。

2.5 生物膜形態學觀察

用0.1%結晶紫染色，在共聚焦倒置顯微鏡下觀察不同亞抑菌濃度的替加環素對所形成的成熟的生物膜的破壞情況。結果顯示，總體趨勢為成膜細菌密度隨著替加環素濃度升高而降低，2 mg/L的替加環素所形成的細菌生物膜非常稀薄，細菌散在存在，而陰性對照組中所形成的細菌生物膜比較濃密，如圖1所示。

表2 亞抑菌濃度替加環素作用于成熟生物膜48 h的影響(OD值,±s)

表3 亞抑菌濃度替加環素作用于成熟生物膜48 h的 影響(OD值,

表4 單因素方差分析4組數據兩兩比較

注：均值差的顯著性水平為 0.05。

注：a、b、c、d依次為陰性對照、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L替加環素作用于成熟生物膜

圖1 替加環素對鮑曼不動桿菌成熟生物膜的影響

3 討論

實驗室的研究結果顯示，生物膜細菌對抗生素和殺菌消毒劑的抵抗力比浮游的非生物膜細菌強100-1000倍，因此細菌耐藥問題是目前人類面臨的最大生存危機[6]。 研究發現,小劑量十四、十五環大環內酯類藥物如紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素等，還有磷霉素均可破壞鮑曼不動桿菌生物膜結構，敏感抗生素和小劑量大環內酯類藥物聯用對于破壞鮑曼不動桿菌生物膜的結果效更理想[7]。乙醇、氯化鈉和大豆油、氯化十六烷吡啶結合，能破壞鮑曼不動桿菌生物膜。一些物理方法如電流、高頻脈沖、超聲震蕩法可以破壞成熟的鮑曼不動桿菌生物膜來提高抗生素對細菌的敏感性[8]。但目前國內對于替加環素作用于生物膜的研究較少。

鮑曼不動桿菌引起的院內獲得性感染已成為患者高發病率和高病死率的主要原因之一，尤其是ICU和免疫力低下的患者[9]。目前鮑曼不動桿菌耐藥性逐年增加，且容易形成生物膜。本研究中的80株MDR-Ab中具有生物膜形成能力的菌株占97.5%，其中生物膜形成陽性菌株占57.5%，強陽性菌株占30%，這也間接說明了細菌多重耐藥的原因之一可能跟生物膜的形成有關。有學者認為耐藥菌株多形成生物膜的原因可能是細菌對抗菌藥物壓力的選擇，同樣它也可以在生物膜的環境下獲得對多種抗菌藥物的耐藥性較高的定植能力與其對抗菌藥物的耐藥性有助于細菌本身的生存,但也有生物膜生成與細菌耐藥性呈負相關的報道[10，11]。目前對這一結論也只是推斷，尚無定論.另外細菌所形成生物膜除屏障作用外，它可以誘導機體補體的轉化，抑制中性粒細胞趨化，抵抗吞噬細胞吞噬,使得生物膜中的鮑曼不動桿菌得以在藻酸鹽的庇護下生長而不被清除，增強其抵御人體免疫防線的能力,當機體的免疫力低下時，極易發生感染[12，13]。

以生物膜方式生存的細菌對抗生素的耐藥性逐漸增強，針對生物膜的研究以試圖解決細菌耐藥性的問題已刻不容緩[14]。磷霉素具有破壞耐藥菌(包括鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌等)的生物被膜的功能和作用[15]。近年來單味中藥、中藥復方制劑、中藥有效成分單體及其衍生物都取得了一定成果，金銀花、五味消毒散、雙黃連、五倍子醇提取液、人參單體等有破壞生物膜的作用[16-18]。本實驗則選用替加環素來破壞鮑曼不動桿菌所形成的生物膜，通過酶標儀所測得的生物膜的OD值和共聚焦倒置顯微鏡高倍鏡下觀察生物膜的形態兩種方式，結果發現替加環素能夠破壞MDR-Ab所形成生物膜，且在亞抑菌濃度范圍內破壞生物膜的能力呈現的趨勢為濃度越大,破壞作用越強，但二者之間并不呈絕對相關性。因為在本實驗中2 mg/L和1 mg/L濃度的替加環素組之間破壞生物膜的能力在統計學上并沒有顯示出顯著性差異(P48 h=0.094,P96 h=0.063),但兩者均與0.5 mg/L濃度的替加環素組在破壞生物膜能力上顯示有差異(P48 h=0.001,0.422,P96 h=0.000,0.378),且2 mg/L與0.5 mg/L濃度的替加環素破壞生物膜能力的差異性更顯著(P48 h=0.001,P96 h=0.000)，因此根據上述數據得出推論生物膜的破壞能力與替加環素的濃度呈正相關的趨勢。本實驗又進行了替加環素作用前后生物膜形態變化的比較。通過鏡下觀察48 h和96 h破膜后的形態變化，發現不加替加環素的陰性對照組形成的生物膜濃密，細菌密度大且聚集存在,最大濃度2 mg/L的替加環素作用組所形成的生物膜最稀薄，細菌散在分布,與上述所測得實驗數據相吻合。綜上所述，替加環素具有破壞成熟生物膜的能力，且與亞抑菌濃度范圍內的替加環素的濃度大小大致呈正相關性。近年來，國內外學者研究發現，生物膜是鮑曼不動桿菌的重要毒力因子，能黏附在各種醫療器械表面而致病[19,20]。在臨床上盡量不使用體內留置性醫療裝置，例如導尿管、動靜脈內留針、各部位的引流管、氣管內插管、接觸性眼鏡、人造血管、人造心瓣膜以及其他人造器官等。對于必須使用的病人應盡量縮短使用時間或經常更換，或者使用經特殊理化方法制成的由抗細菌粘附生物材料構成的導管，或使用含有抗菌物質制成的導管[21]。Singh等發現乳鐵蛋白通過結合鐵離子使細菌進入一種移動狀態，在移動時不易形成微菌落從而抑制BF發育，但BF一旦成熟，其作用也就不明顯了[22]。可見對形成生物膜的鮑曼不動桿菌感染預防和治療是一項綜合且艱巨的任務,對于生物膜在細菌耐藥中的作用以及生物膜所形成的機制仍需探索，本實驗重點闡述了多重耐藥的鮑曼不動桿菌可以形成生物膜及替加環素在亞抑菌濃度下可以破壞生物膜，為臨床上對抗細菌耐藥性提供理論依據。

[1]陳 波,曼 余.加林細菌生物膜形成與細菌耐藥機制研究進展[J]．中國抗生索雜志,2005,30(10):S1.

[2]唐俊妮,史賢明,王紅寧,等.細菌生物膜調控機制[J].生物學雜志,2009,26(2):48.

[3]Wroblewska MM,Sawicka-Grzelak A,Marchel H,et al.Biofilm production by clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated from patients hospitalized in two tertiary care hospitals[J].FEMS Immunol Med Microbiol，2008,53(1):140.

[4]Obeidat N，Jawdat F，AI Bakri AG，et al．Major biologic charac-teristics of Acinetobacter baumannii isolates from hospital environ-mental and patient' respiratory tract sources[J].Am J Infect Control，2014，42(4):401．

[5]Wang LF,Li JL,Ma WH,et al.Drug resistance analysis of 1914 bacterial strains isolated from burn patients[J].Genet Mol Res,2014,13(4):9727.

[6]Gilbert P,Allison DG,Mcbain AJ,et al.Biofilm in vitro and in viro:Do singular michanisms imply cross-resistance[J].Appl Microbiol,2002,92(suppl):92s.

[7]Ozbek B,Mataraci E.In vitro effectiveness of colistin,tigecycline and levofloxacin alone and combined with clarithromycin and/or heparin as lock solutions against embedded Acinetobacter baumannii strains[J].JAntimicrob Chemother,2013,68(4):827.

[8]Hwang YY,Ramalingam K,Bienek DR,et al.Antimicrobial activity of nanoemulsion in combination with cetylpyridinium chloride inmultidrug-resistant Acinetobacter baumannii[J].Antimicrob Agents Chemother,2013,57(8):3568.

[9]Playford EG,Crmg JC,Iredell JR .Carbapenem-resistant Acinetobacter banmannii in intensive care unit patients：risk factors for acquisition，infection and their consequences[J].Hosp Infect,2007,65(3):204．

[10]Cevahir N,Demir M,Kaleli H,et al.Evaluation of biofilm production,gelatinaseactity,and mannose-resistant hemagglutination in Acinetobacter baumanniistrains[J].Microbiol Immunol Infect,2008,41(6):513.

[11] Rao RS,Karthika RU,Singh SP,et al.Correlation between biofilm production and multiple drugresistance in imipenem resistant clinical isolates ofAcinetobacterbaumannii[J].MedMicrobiol,2008,26(4):333.

[12]Thurlow LR,Hanke ML,Fritz T,et al.Staphylococcus aureus biofilms prevent macrophage phagocytosis and attenuate inflammation in vivo[J].Immunol,2011,186(11):6585.

[13]Edward BJ,Philipf U.Optimal treatment of infected diabetic footulcers[ J] .Drugs Aging,2004,21(13):833.

[14]Rasmussent B,Givskov M.Quorum-sensing inhibitors as anti-pathogenic drugs[J].Med Microbiol,2006,296(2-3):149.

[15]Falagas ME.Kastoris Ac,KarageorgopouLos DE,et al.Fostmycin for the treatment of infections caused by multidrug-risistant non-fermenting Gram-negative bacill:a systematic review of microbiological[J].Antimicrob Agents,2009,34(2):111.

[16]何 敏.金銀花對細菌生物膜的抑制作用及其化學成分研究[D].長春:長春中醫藥大學,2011.

[17]Wong RW,Hagg U,Samaranayake L,et al.Antimicrobial activity of Chinese medicine herbs against common bacteria in oral biofilm.A pilot study[J].Oral Maxillofac Surg,2010,39(6):599.

[18]曾祥萍.AL-1 單用及聯合用藥對銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制作用及其作用機理研究[D].廣州:暨南大學,2011.

[19]Landini P，Antoniani D，Burgess JG，et al．Molecular mechanisms of compounds affecting bacterial biofilm formation and dispersal[J].Appl Microbial Biotechnol,2010,86(3):813.

[20]長 亮.鮑曼不動桿菌生物膜形成的調節[J].中國感染控制雜志，2012,11(3):228．

[21]Pascual A.Pathogenesis of catheter-related infections:Lessons for new designs[J].Clin Microble Infect,2002,8(5):256.

[22]singh PK.Ironsequestration by human lactoferrin stimulates P.aeruginosa Surface motility and blocks biofilmformation[J]．Biometals，2004,17(3):267.

1007-4287(2017)02-0329-04

2016-03-16)