高糖條件下鋅對視網膜Müller細胞分泌VEGF的影響

陳艷艷，楊 威，李愛朋，侯璐璐，盧伯洋，董 宇

(吉林大學第一醫院 眼二科，吉林 長春130021)

*通訊作者

高糖條件下鋅對視網膜Müller細胞分泌VEGF的影響

陳艷艷，楊 威，李愛朋，侯璐璐，盧伯洋，董 宇*

(吉林大學第一醫院 眼二科，吉林 長春130021)

糖尿病性視網膜病變(DR)是糖尿病常見且嚴重的微血管并發癥之一，糖尿病患者視網膜缺血缺氧，導致血管內皮生長因子(VEGF)代償性增加，促進了視網膜新生血管的形成。Müller細胞是視網膜分泌VEGF的主要細胞，在糖尿病患者早期即會產生一系列病理生理的改變，從而導致VEGF的表達增加,在DR的發展中起著至關重要的作用。鋅本身在抗氧化和抑制糖尿病所致的視網膜損傷上具有多方面生理作用，而糖尿病患者血清鋅水平與血糖呈顯著負相關，本實驗擬通過體外培養視網膜Müller細胞，觀察補鋅能否抑制體外培養的Müller細胞VEGF表達的增加。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DAB顯色劑(武漢博士德公司)、H-DMEM培養基(Gibco BRL Co.)、標準胎牛血清(蘭州民海公司 )、兔抗鼠VEGF 多克隆抗體(武漢博士德公司)、免疫組織化學SP試劑盒(武漢博士德公司)、 TritonX-10(Promega 公司)、胰蛋白酶 (Hylclone Co)。

1.2 Müller 細胞的原代及傳代培養

將出生后3-5天大乳鼠(雌雄不限)(吉林大學動物中心提供)，用75%酒精浸泡麻醉后，無菌操作取出眼球，PBS液沖洗3遍，沿角膜緣旁約1 mm處環行剖開眼球，去除晶狀體和玻璃體，留后半眼球壁置于DMEM培養液中輕輕剝離視網膜，去除富含血管及髓放線后將視網膜剪碎成約1 mm×1 mm小片組織。吸取組織塊置于培養瓶中，加足量含20%標準胎牛血清的DMEM培養液，置于5%CO2，37℃恒溫孵箱內培養。約7天后，細胞從組織塊周邊爬出并達到80%以上融合，此時進行消化傳代：將培養瓶內培養液吸出，加入0.1 mol/L PBS輕輕沖洗殘余培養液2次，小心吸出后加入2 ml 0.25%胰蛋白酶37℃下消化，顯微鏡下觀察，當細胞周邊剛剛回縮即停止，加入等量含血清的DMEM培養液，用吸管吹打后吸入離心管中離心800 r/min×5 min，棄上清液，加入培養液重懸沉淀，1∶2-1∶3移入培養瓶中培養，第2代細胞供實驗用。

1.3 Müller細胞的鑒定

視網膜Müller 細胞的免疫組化染色按試劑盒說明書操作。結果判定：以在細胞的胞膜、胞漿或胞核部位出現棕黃色顆粒者判定為陽性，陽性細胞在蓋片上分布須均勻一致。

1.4 實驗分組

將2代培養細胞分為4組。正常組(N)：5 mmol/L葡萄糖DMEM培養液；高糖組(G)：25 mmol/L葡萄糖DMEM培養液；正常加鋅組(N+Z)：本組僅加5.0 μmol/L ZnSO4。高糖加鋅組(G+Z)： 分別加入2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、7.5 μmol/L、10 μmol/L ZnSO4。各組加入條件液后繼續培養6天。

1.5 結果判定

采用Imagepro-Plus軟件進行數據分析，應用計算機圖像處理技術測定染色細胞累積光密度(IOD)。每張片子取五個視野，每個視野選定10個左右細胞測定灰度值。

1.6 統計學分析

2 結果

高糖組前5天Müller細胞VEGF水平高于高糖加鋅組,到第6天高糖組Müller細胞VEGF水平接近甚至低于高糖加鋅組;高糖組與正常組相比,前5天Müller細胞VEGF水平顯著升高,第6天基本降至正常,Müller細胞VEGF表達在第四天達高峰,高糖組與高糖加鋅組比較，Müller細胞VEGF水平顯著增高,并具有顯著性差異(P<0.01),高糖組與正常組比較Müller細胞VEGF表達水平顯著增高,具有顯著性差異(P<0.01);正常加鋅組、正常組與高糖加鋅組比較Müller細胞VEGF表達水平均無統計學差異(P<0.05)(表1)。

表1 各組Müller細胞VEGF表達灰度值結果

與正常組比較，*P<0.01，與高糖組比較，△P<0.01

3 討論

糖尿病是一個糖尿病性視網膜病變(DR)的發生是由于糖尿病所造成的缺血缺氧的體內環境，致使氧化應激增加，氧自由基增多，氧化產物堆積，損傷了視網膜組織，造成微血管病變并導致血管閉塞，進而導致促血管生成因子和抑制因子的失衡，造成新生血管的形成.而新生血管生成因子中以VEGF研究頻率最高，VEGF能特異作用于視網膜內皮細胞，可能是最直接的眼內新生血管形成因子。正常條件下表達 VEGF 的細胞有多種細胞，包括神經節細胞、Müller細胞、周細胞和視網膜色素上皮細胞等，糖尿病時Müller 細胞VEGF分泌增加，在DR發生發展中起至關重要的作用[1]，本實驗便是從Müller細胞著手，尋找抑制Müller細胞分泌VEGF的有效途徑和方法。

本實驗中采用25 mmol/L的高糖濃度體外培養Müller細胞，可以模擬糖尿病時體內高血糖狀態[2]，正常條件下各時相Müller細胞VEGF的表達一直處于低且平穩的水平，上下起伏波動不明顯，而高糖條件下1天、2天、3天、4天Müller細胞VEGF明顯隨著時間延長表達顯著增加，第5天開始下降，但仍明顯高于正常對照組，第6天降至接近甚至低于正常水平，說明了正常條件下視網膜Müller細胞VEGF穩定低表達，而高糖條件可以誘導Müller細胞VEGF的表達增加，且第1到第4天表現出明顯的時間依賴性，隨時間延長表達亦顯著增加，直到第5天、第6天細胞出現形態改變，功能下降，部分細胞失去表達VEGF的功能，導致VEGF逐漸下降到等同甚或低于正常條件組細胞VEGF表達量，此時的細胞狀態已經衰老達不到正常細胞的狀態，在本實驗中，高糖組及高糖加鋅組至第6天時VEGF表達反而下降，可能與此有關。實驗中發現在高糖條件下，隨時間延長，VEGF表達增加的現象，與臨床上我們看到的隨糖尿病病程越長，發生DR的可能性亦逐漸增加相一致。

目前國外大量體內、外研究均證實，鋅在1型和2型糖尿病發展過程中發揮重要作用，在T2D患者，隨著血清鋅水平的下降，糖尿病微血管并發癥發病率的增加，補鋅可以改善血糖控制、降低糖尿病微血管病的發生率[3-6]。Moustafa研究表明鋅可以防止糖尿病大鼠視網膜氧化應激過程并控制高血糖[7]。但是鋅缺乏作為糖尿病微血管并發癥的病因的證據還有待于更多的臨床研究證實[8]。本實驗通過體外高糖條件下培養的Müller細胞加鋅，研究補鋅對高糖情況下Müller細胞VEGF表達的影響，我們發現加鋅對高糖條件下培養的Müller細胞VEGF表達有明顯抑制作用，與國外研究結果相一致。高糖加鋅組同正常組及正常加鋅組比較無差異性(P>0.05)，而高糖加鋅組和高糖組細胞比較其VEGF表達水平具有顯著性差異(P<0.01)，說明鋅對高糖條件下Müller細胞VEGF的分泌具有抑制效應，試驗中我們發現高糖加鋅組中5.0 μmol/L鋅濃度下與正常條件下各時相Müller細胞VEGF的表達曲線變化相接近，但因該研究尚處于體外培養細胞研究階段，是否為或接近為臨床最佳治療濃度，仍需大量研究證實，故適用于人類的最佳治療鋅濃度也可能成為未來研究熱點。

[1]Robbins MA,Cepko CL.Control of Muller glial cell proliferation and activation following retinal injury[J].Nat.Neurosci,2000,3(9):873.

[2]薛慶善,主編.體外培養的原理與技術[M].北京：科學出版社,2001．483-484.

[3]Flannick J,Thorleifsson G,Beer NL,et al.Loss-of-function mutations in SLC30A8 protect against type 2 diabetes[J].Nat Genet,2014,46:357.

[4]Shan Z,Bao W,Zhang Y,et al.Interactions between zinc transporter-8 gene (SLC30A8) and plasma zinc concentrations for impaired glucose regulation and type 2 diabetes[J].Diabetes,2014,63:1796.

[5]Wenzlau JM,Frisch LM,Hutton JC,et al.Changes in zinc transporter 8 autoantibodies following type 1 diabetes onset:The type 1 diabetes genetics consortium autoantibody workshop[J].Diabetes Care,2015,38(Suppl 2):S14.

[6]Ranasinghe P,Pigera S,Galappatthy P,et al.Zinc and diabetes mellitus: understanding molecular mechanisms and clinical implications[J].Daru,2015,23(1):44.

[7]Moustafa SA.Zinc might protect oxidative changes in the retina and pancreas at the early stage of diabetic rats[J].Toxicol Appl Pharmacol,2004,201:149.

[8]Ying-Ying Luo,Jie Zhao,Xue-Yao Han,et al.Relationship Between Serum Zinc Level and Microvascular Complications in Patients with Type 2 Diabetes[J].Chin Med J (Engl),2015,128(24): 3276.

1007-4287(2017)02-0307-03

2016-04-15)