探討鍵合表阿霉素納米膠束對肝癌Walker-256細(xì)胞周期的影響

宋曉斌，李晨玉，方曉白，張 鑫，宋金明，劉銅軍，饒艷偉，楊 威

(1.吉林省人民醫(yī)院 急診外科,吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

探討鍵合表阿霉素納米膠束對肝癌Walker-256細(xì)胞周期的影響

宋曉斌1，李晨玉1，方曉白1，張 鑫1，宋金明1，劉銅軍3，饒艷偉1，楊 威2*

(1.吉林省人民醫(yī)院 急診外科,吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，早期診斷困難，手術(shù)切除率低，臨床治療以化學(xué)療法為主。傳統(tǒng)的小分子化療藥物缺乏對腫瘤組織的特異性，間斷性的沖擊化療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會對正常組織產(chǎn)生毒副作用，并易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生，遠(yuǎn)期療效并不滿意[1]。因此，以提高藥效和降低藥物副作用為目的的納米靶向控釋系統(tǒng)應(yīng)用在肝癌化學(xué)療法中逐漸成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

表阿霉素(EPI)是蒽環(huán)類抗癌抗生素的新成員，目前在臨床上已逐漸代替阿霉素(ADM)，成為肝癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤的一線用藥。Cyclin1是P53基因的一個(gè)靶向轉(zhuǎn)錄因子，Cyclin1啟動子中包含兩個(gè)P53結(jié)合位點(diǎn)[2]，當(dāng)發(fā)生基因損傷時(shí)，P53激活，Cyclin G1表達(dá)增高，抑制細(xì)胞發(fā)生增殖。Cyclin G被認(rèn)為是在細(xì)胞周期G2/M期起主要調(diào)節(jié)作用[3]。

所以，本研究設(shè)想以EPI為前體藥物，采用透析法制備化學(xué)鍵合的載表阿霉素納米膠束(EPI-NPs)，研究EPI-NPs對Walker-256細(xì)胞的增殖相關(guān)蛋白的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑 表阿霉素(EPI)原藥購于浙江海正制藥有限公司，空白及鍵合表阿霉素納米膠束于中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所制備，Cyclin G1蛋白抗體(美國 Abcam公司)。肝癌Walker-256細(xì)胞株購自北京醫(yī)科院腫瘤研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Walker-256細(xì)胞株為液氮冷凍保存，實(shí)驗(yàn)復(fù)蘇Walker-256細(xì)胞株，加入DMEM培養(yǎng)液，以2×104/cm2的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃,5%CO2的恒溫培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，Walker-256細(xì)胞為貼壁生長細(xì)胞。細(xì)胞傳代采用0.4%胰酶消化，正常組給予更換培養(yǎng)液；空白鍵束組給予更換含0.5 μg/ml的空白鍵束培養(yǎng)液；EPI組給予更換含5 μg/ml的EPI培養(yǎng)液；EPI-NPs組為更換含5 μg/mlEPI-NPs培養(yǎng)液，進(jìn)行72小時(shí)培養(yǎng)，之后進(jìn)行相關(guān)分子生物學(xué)檢測。

1.3 MTT法檢測胃癌細(xì)胞存活率 按使用說明書用MTT法(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)檢測細(xì)胞增殖能力。全自動酶標(biāo)儀(波長492 nm)測定各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 取對數(shù)生長期的Walker-256細(xì)胞，消化后以5×105接種于50 cm2培養(yǎng)瓶，分別按前述方式加入5 μg/ml的EPI和EPI-NPs，以及0.5 μg/ml的PEG-b-P(LA-co-DHP/NPC)空白膠束，對照組加入等體積DMEM培養(yǎng)液。72 h后，分別用胰酶消化，收集細(xì)胞2×106個(gè)，1 000 rpm離心5 min，棄去培養(yǎng)液。按照試劑盒說明書處理后，混勻后上流式細(xì)胞儀做單參數(shù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用累積曲線分割法計(jì)算各期細(xì)胞所占比例。

1.5 Western Blot檢測肝癌Walker-256細(xì)胞中Cyclin G1蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，Bio-Rad法測定蛋白含量，測定樣品的蛋白濃度。用Image J圖像處理軟件計(jì)算各條豆類灰度值，分析Cyclin G1蛋白的表達(dá)情況。目的蛋白與內(nèi)參照β-肌動蛋白(β-actin)灰度值的比值進(jìn)行表述。

2 結(jié)果

2.1MTT法檢肝癌Walker-256細(xì)胞的增殖率

細(xì)胞增殖率顯示：與正常組相比，空白鍵束組沒有明顯的改變，但是在EPI組和EPI-NPs組的Walker-256細(xì)胞增殖率顯著降低，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與EPI組相比，EPI-NPs組的Walker-256細(xì)胞增殖率降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

**P<0.01：與對照組相比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；#P<0.05：與EPI組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 MTT檢測肝癌Walker-256細(xì)胞增殖率

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測肝癌Walker-256細(xì)胞經(jīng)EPI-NPs處理后細(xì)胞周期的改變

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：發(fā)現(xiàn)Walker-256細(xì)胞在對照組和空白鍵束組沒有明顯的區(qū)別；EPI組和EPI-NPs組細(xì)胞停滯于G2/M期的細(xì)胞數(shù)均明顯高于對照組(P<0.05)；與EPI組相比，EPI-NPs組的G2/M期的細(xì)胞數(shù)明顯增高(P<0.01)，見表1。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測肝癌細(xì)胞細(xì)胞 周期分布

**P<0.01：與對照組相比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；#P<0.05：與EPI組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 Western Blot檢測肝癌Walker-256細(xì)胞Cyclin G1蛋白表達(dá)

與正常組相比，空白鍵束組的組中Cyclin G1表達(dá)沒有明顯變化，而EPI組和EPI-NPs組中的Cyclin G1蛋白表達(dá)明顯降低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與空白鍵束組相比，EPI組和EPI-NPs組中的Cyclin G1表達(dá)也明顯降低(P<0.01)。與EPI組相比，EPI-NPs組中的Cyclin G1明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

3 討論

原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，早期診斷困難，手術(shù)切除率低，臨床治療以化學(xué)療法為主。傳統(tǒng)的小分子化療藥物缺乏對腫瘤組織的特異性，間斷性的沖擊化療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會對正常組織產(chǎn)生毒副作用，并易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生，遠(yuǎn)期療效并不滿意。本研究以提高藥效和降低藥物副作用為目的采用EPI-NPs治療肝癌。前期研究結(jié)果表明了EPI-NPs在肝癌Walker-256細(xì)胞中有良好的緩釋性，其釋放速率隨著PH的降低而升高，且其隨著作用時(shí)間的增加，而表現(xiàn)出了良好的細(xì)胞毒性。介于其良好的緩釋性和細(xì)胞毒性，我們進(jìn)步探討其在肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制。首先我們檢測細(xì)胞的增值率，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)72 h后，EPI-NPs組的細(xì)胞增殖率的抑制作用明顯比EPI組高，這說明在肝癌的化療過程中EPI-NPs有很高的抑制作用。在細(xì)胞周期中，G2/M期是細(xì)胞增殖的重要階段，是細(xì)胞周期的兩個(gè)調(diào)節(jié)點(diǎn)之一。表阿霉素的主要作用機(jī)制即是在DNA復(fù)制過程中誘導(dǎo)TOPOⅡ抑制劑，DNA斷裂物復(fù)合物的形成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并使細(xì)胞阻滯于G2/M期[4]。我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞絕大多數(shù)都被抑制在G2/M，且EPI-NPs組與EPI組相比，抑制數(shù)明顯增高。所以，我們進(jìn)一步的懷疑了EPI-NPs是否通過影響細(xì)胞周期性蛋白來調(diào)控細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸。

圖2 Western Blot檢測肝癌Walker-256

現(xiàn)階段認(rèn)為Cyclin1蛋白是P53基因的靶向轉(zhuǎn)錄因子，Cyclin1啟動子中有兩個(gè)P53結(jié)合位點(diǎn)[2]，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生基因損傷時(shí)，P53被激活，Cyclin G1表達(dá)增高，抑制細(xì)胞發(fā)生增殖。在我們的前期的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過EPI-NPs處理的肝癌細(xì)胞中P53是被激活的。為了驗(yàn)證EPI-NPs是否通過影響細(xì)胞周期性蛋白來調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)歸的，我們通過Western Blot法檢測了細(xì)胞周期性相關(guān)蛋白Cyclin G1的表達(dá)，研究結(jié)果與我們預(yù)期一致，在EPI-NPs組中Cyclin G1蛋白高表達(dá)，而且其表達(dá)水平明顯高于EPI組。所以，這充分的說明了EPI-NPs通過影響細(xì)胞周期性相關(guān)蛋白Cyclin G1來改變細(xì)胞的增值率的。在Xiaoming Zhao[5]等的研究結(jié)果中證明了Cyclin G1和MEF2D可以通過miR-122的作用下調(diào)了肺癌細(xì)胞的生存率。這進(jìn)一步說明了Cyclin G1對細(xì)胞的增值的影響。

總之，本研究證明了EPI-NPs能增加肝癌Walker-256細(xì)胞的增值抑制作用，其主要通過改變細(xì)胞周期的G2/M的來實(shí)現(xiàn)的，可能通過P53/Cyclin G1細(xì)胞途徑來實(shí)現(xiàn)的。

[1]Nori A,KoPecek J.Intracellular targeting of polymer-bound drugs for cancer chemotherapy[J].Adv Drug Deliv Rev,2005,57(4):609.

[2]Thomas M,Deiters A .MicroRNA miR-122 as a therapeutic target for oligonucleotides and small molecules[J].Curr Med Chem,2009,20:3629.

[3]Jiang L,Liu R,Wang Y,et al.The role of Cyclin G1 in cellular proliferation and apoptosis of human epithelial ovarian cancer[J].J Mol Histol,2015,46(3):291.

[4]Zimmermann M,Arachchige-Don AS,Donaldson MS,et al.Elevated Cyclin G2 expression intersects with DNA damage checkpoint signaling and is required for a potent G2/M checkpoint arrest response to doxorubicin[J].J Biol Chem，2012,287(27):22838.

[5]Zhao X,Liu M,Li D.Oleanolic acid suppresses the proliferation of lung carcinoma cells by miR-122/Cyclin G1/MEF2D axis[J].Mol Cell Biochem，2015,400(1-2):1.

吉林省科技廳資助項(xiàng)目(No.20130206033SF)

1007-4287(2017)02-0313-03

宋曉斌，男，副主任醫(yī)師，博士研究生；楊威，女，副主任醫(yī)師，博士研究生。

2016-10-16)

*通訊作者