抑制COX-2表達(dá)通過Akt/iNOS/NO信號通路發(fā)揮抗凋亡作用機(jī)制的研究

孫小婷,姜 曦,龐 磊,麻海春*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院1.麻醉科;2.健康管理中心,吉林 長春130021)

抑制COX-2表達(dá)通過Akt/iNOS/NO信號通路發(fā)揮抗凋亡作用機(jī)制的研究

孫小婷1,姜 曦2,龐 磊1,麻海春1*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院1.麻醉科;2.健康管理中心,吉林 長春130021)

目的 探討心肌缺血/再灌注損傷過程中環(huán)氧化酶-2(COX-2)的表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡之間聯(lián)系及作用機(jī)制。方法 通過對心肌細(xì)胞進(jìn)行缺氧/復(fù)氧(H/R)實(shí)驗，模擬心肌缺血再灌注過程，檢測COX-2及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；采用COX-2特異性抑制劑NS398對其活性進(jìn)行抑制，觀察細(xì)胞凋亡水平的變化，并研究其作用機(jī)制。結(jié)果 與對照組相比，在H/R組中，Bcl2表達(dá)明顯減少，cleaved capase-3的表達(dá)明顯增強(qiáng)；在NS398預(yù)處理后，cleaved caspase-3的表達(dá)明顯減少，Bcl2表達(dá)增強(qiáng)，TUNEL試驗結(jié)果提示，NS398預(yù)處理明顯減少陽性細(xì)胞的比例。結(jié)論 在心肌細(xì)胞中，H/R刺激能夠激活COX-2表達(dá)，并通過促凋亡途徑導(dǎo)致細(xì)胞損傷；抑制COX-2活性能夠激活A(yù)kt/iNOS/NO信號通路，并進(jìn)而通過抗凋亡機(jī)制，發(fā)揮對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

COX-2；心肌缺血/再灌注損傷；缺氧/復(fù)氧；心肌細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

(ChinJLabDiagn,2017,21:0290)

在心肌缺血過程中，細(xì)胞中環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)表達(dá)水平顯著增高，且心肌梗死時細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度與COX-2表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示COX-2的表達(dá)可能與缺血性心肌病相關(guān)[1-3]。盡管文獻(xiàn)報道在心肌缺血再灌注損傷(MI/ RI)的動物模型中，COX-2的表達(dá)具有心肌保護(hù)作用，但更多的報告傾向于COX-2表達(dá)的增強(qiáng)在MI/ RI中扮演有害角色[4-7]。在大鼠[4-6,8]、兔子[6]和狗[7]等動物模型中，采用COX-2特異性抑制劑對動物進(jìn)行預(yù)處理后，動物的心功能明顯提高，心肌梗死面積也有所下降[9]。本研究通過缺氧/復(fù)氧(hypoxia/ reoxygenation，H/ R)實(shí)驗，模擬心肌缺血再灌注過程，分別在心肌細(xì)胞株H9C2細(xì)胞和原代大鼠心肌細(xì)胞中探究COX-2表達(dá)水平與Akt/iNOS/NO信號通路之間潛在聯(lián)系及分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗分組

細(xì)胞系H9C2購自American Type Culture Collection公司 (ATCC,Manassas,VA,USA)，大鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法詳見文獻(xiàn)[10]。分別將H9C2細(xì)胞與大鼠心肌細(xì)胞分別隨機(jī)分為三組：對照組(CTL)、缺氧/復(fù)氧組(H/R組)和給藥組(H/R +NS398組)。前期工作顯示，采用10μM COX-2特異性抑制劑NS398對細(xì)胞預(yù)處理1小時能夠明顯抑制COX-2的活性。

1.2 MTT試驗

培養(yǎng)基中的乳酸鹽脫氫酶(LDH)水平是評估細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)[11]，采用LDH檢測試劑盒(Cat.no.11644793001Roche,Mannheim,Germany)分別對H9C2細(xì)胞和大鼠心肌細(xì)胞的活力進(jìn)行評估。

1.3 Western blot實(shí)驗

分別提取各組中H9C2細(xì)胞和大鼠心肌細(xì)胞中的蛋白，通過western blot對其蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，所用抗體及其滴度如下：COX-2(1∶1000)、iNOS(1∶40)、GADPH (1∶1000)、總caspase-3 (1∶1000)、 cleaved caspase-3 (1∶1000)、Akt (1∶1000)、p-Akt (1∶1000)，各抗體購買公司請參見文獻(xiàn)[10]。采用Image J軟件對蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。1.4 TUNEL試驗

將H9C2細(xì)胞接種在載玻片上，在經(jīng)過不同處理之后，采用原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Cat.no.11684817910,Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)對其進(jìn)行TUNEL染色，判定心肌細(xì)胞凋亡水平。

1.5 COX-2活性檢測

采用COX熒光活性分析試劑盒(Cat.no.700200,Cayman)測定不同組別細(xì)胞中COX-2的活性。

1.6 測定細(xì)胞內(nèi)一氧化氮(NO)含量

在有或無H/R刺激下，NS398 (10 μM 1小時) 或者 LY294002 (10 μM 1小時)[12]或者1400W (1μM 30分鐘)[13]將H9C2細(xì)胞培養(yǎng)在96孔黑色的聚苯乙烯板上(Cat.no.3916,Corning Life Sciences)檢測細(xì)胞內(nèi)NO。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用Mann-Whitney U測試或者單向方差分析及Tukey’s后檢驗，使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行做圖，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H/R介導(dǎo)的COX-2表達(dá)水平上升

在H/R后，實(shí)驗組LDH釋放明顯增多，提示H/R心肌細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功(圖1A)，且實(shí)驗組中COX-2的表達(dá)顯著上升(圖1B)。然而，在經(jīng)過COX-2特異性抑制劑NS398預(yù)處理之后，LDH的釋放明顯減少(圖2A)，細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)(圖2B)。

圖1A 在H/R后，LDH釋放的比較( *P<0.05 CTL vs.H/R or H/R+Helenalin,#P<0.05 H/R vs.H/R+Helenalin)

圖1B 在H9C2心肌細(xì)胞中，H/R后，COX-2表達(dá)的比較( *P<0.05 CTL vs.H/R or H/R+Helenalin,#P<0.05 H/R vs.H/R+Helenalin)

圖2A 經(jīng)過COX-2特異性抑制劑NS398預(yù)處理，LDH的釋放比較(*P<0.05 CTL vs.H/R or H/R + NS398,#P<0.05 H/R vs.H/R + NS398)

圖2B 經(jīng)過COX-2特異性抑制劑NS398預(yù)處理，細(xì)胞活力的比較(*P<0.05 CTL vs.H/R or H/R + NS398,#P<0.05 H/R vs.H/R + NS398)

2.2 在H9C2細(xì)胞中，抑制COX-2活性能夠減輕H/R介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

與對照組相比，在H/R組中，Bcl2表達(dá)明顯減少，cleaved capase-3的表達(dá)明顯增強(qiáng)。而在NS398預(yù)處理后，cleaved caspase-3的表達(dá)明顯減少，Bcl2表達(dá)增強(qiáng)(圖3A)。此外，TUNEL試驗結(jié)果提示，NS398預(yù)處理明顯減少陽性細(xì)胞的比例(圖3B)。

圖3A 在H9C2細(xì)胞中，cleaved caspase-3、Bcl2表達(dá)的比較(*P<0.05 CTL 圖3B 在H9C2細(xì)胞中,熒光顯微鏡下陽性

vs.H/R or H/R + NS398,#P<0.05，H/R vs.H/R + NS398) 細(xì)胞的比例的比較(*P<0.05，CTLvs.H/R or H/R + NS398；#P<0.05，H/R vs.H/R + NS398)

2.3 成年大鼠心肌細(xì)胞中，COX-2參與了H/R介導(dǎo)的細(xì)胞損傷與凋亡

H/R明顯增加了原代心肌細(xì)胞中LDH的釋放，cleaved caspase-3的表達(dá)，并減弱了細(xì)胞活力(圖4)。在NS398預(yù)處理之后，LDH的釋放明顯減少(圖4A)，細(xì)胞活力增強(qiáng)(圖4B)，cleaved caspase-3表達(dá)水平降低(圖4C)。

圖4 (A,B,C)在原代成年大鼠心肌細(xì)胞中，LDH的釋放、cleaved caspase-3 表達(dá)、細(xì)胞活力的比較(*P<0.05 CTL vs.H/R,#P<0.05 H/R vs.H/R + NS398)

2.4 在H9C2細(xì)胞中，抑制COX-2活性能夠激活A(yù)kt/iNOS/NO信號通路

結(jié)果顯示，NS398預(yù)處理后，p-Akt表達(dá)水平顯著提高(圖5A)。在LY294002預(yù)處理后，p-Akt的表達(dá)受到了明顯的抑制(圖5A)，并失去了對心肌的保護(hù)作用，即LDH釋放增多、cleaved caspase-3水平上升、細(xì)胞活力減弱(圖5A,B,C)。同H/R組相比，H/R+NS398組中檢測到了高濃度的NO，而這一過程能夠被LY294002抑制(圖5D)。在H/R+NS398組中，cleaved caspase-3蛋白水平上升，LDH釋放增多，細(xì)胞活力減弱，細(xì)胞內(nèi)NO水平受到明顯抑制。

圖5(A) 總Akt、p-Akt、cleaved caspase-3、iNOS表達(dá)水平的比較(*P<0.05 CTL vs.H/R or H/R + NS398 or H/R+NS398+LY294002,#P<0.05 H/R vs.H/R+NS398,ΔP<0.05 H/R+NS398 vs.H/R+NS398+LY294002)

圖5(B) LDH釋放水平的比較((*P< 圖5(C,D) 細(xì)胞活力、NO濃度的比較((*P<0.05 CTLvs.H/R or H/R+0.05 CTL vs.H/R or H/R+ NS398 or H/R+NS398+LY294002,#P<0.05 H/R vs.H/RNS398 or H/R+NS398+LY +NS398,ΔP<0.05 H/R+NS398 vs.H/R+NS398+LY294002)294002,#P<0.05 H/R vs.H/R+NS398,ΔP<0.05 H/R+NS398 vs H/R+NS398+LY294002)

3 討論

在生理條件下，組織中的COX-2表達(dá)水平很低或不表達(dá)，前期研究結(jié)果顯示在不同的心肌缺血再灌注動物模型中，COX-2選擇性抑制劑處理可以明顯增強(qiáng)心功能，并且減少心肌梗死的面積[4-7]。這一結(jié)論與我們在細(xì)胞模型實(shí)驗中的發(fā)現(xiàn)一致，然而目前為止，并沒有研究闡述抑制COX-2活性是通過何種途徑發(fā)揮心肌保護(hù)作用的。在本研究中，我們通過H/ R實(shí)驗，模擬心肌缺血再灌注過程，并采用COX-2特異性抑制劑NS398分別作用于H9C2細(xì)胞和原始成年大鼠心肌細(xì)胞，對其COX-2活性進(jìn)行特異性抑制，結(jié)果顯示，抑制COX-2活性能夠明顯緩解H/R所介導(dǎo)的細(xì)胞損傷，如LDH釋放量增多、細(xì)胞活力下降等。

細(xì)胞凋亡主要包括內(nèi)源性和外源性兩種途徑[14]。在內(nèi)源性途徑中，當(dāng)細(xì)胞感受到刺激時，促凋亡蛋白(如Bax)破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致線粒體功能障礙和細(xì)胞色素的釋放，然而抗凋亡蛋白(如Bcl2)則可通過干擾促凋亡細(xì)胞聚集來阻止細(xì)胞凋亡進(jìn)程[15,16]。在外源性途徑中，配體與細(xì)胞表面凋亡受體相結(jié)合，形成凋亡復(fù)合體并且激活caspase-8和caspase-10，它們能夠裂解caspase-3，聚集外源性和內(nèi)源性半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)[8,14]。研究表明H/R刺激可以通過內(nèi)源性和外源性途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[8,17,18]，然而心肌細(xì)胞受H/R刺激的作用時間不同可能引發(fā)不同的凋亡途徑。在本研究中，在H/R組中，Bcl2表達(dá)明顯減少，cleaved capase-3的表達(dá)明顯增強(qiáng)，這些結(jié)果提示H/R刺激可能分別通過內(nèi)源性和外源性兩條途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。值得注意的是，在H/R刺激下Bax表達(dá)水平并沒有發(fā)生變化，這可能歸因于目前實(shí)驗設(shè)置中特異的H/R條件(6小時缺氧和12小時復(fù)氧)。采用COX-2特異性抑制劑NS398對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理能明顯的減少H/R刺激所介導(dǎo)的上述不良事件，以上結(jié)果提示，抑制COX-2活性可能是通過減少細(xì)胞凋亡來減輕H/R所介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

緊接著我們研究了抑制COX-2是如何減少H/R所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的。Akt信號通路在調(diào)控心肌細(xì)胞存活與凋亡中扮演重要角色[19]。在本研究中，H/R刺激在誘導(dǎo)COX-2表達(dá)的同時伴隨著Akt磷酸化水平下降，而抑制COX-2表達(dá)則能夠促進(jìn)Akt活化。iNOS是Akt的下游靶點(diǎn)[20]，在MI/ IR過程中，活化的Akt能夠通過調(diào)節(jié)iNOS水平，誘導(dǎo)NO合成[19,21]。在本研究中，當(dāng)H9C2細(xì)胞中COX-2表達(dá)受到抑制時，細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化水平提高，并伴隨著iNOS表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)NO濃度上升，然而，這一過程能夠被Akt特異性抑制劑LY294002 或者iNOS 特異性抑制劑1400W 阻斷，從而失去對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。綜上，這些觀察表明，抑制COX-2可能通過Akt/iNOS/NOS信號通路的活化來防御細(xì)胞凋亡。

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Inhibition of COX-2 protects against cardiomyocyte apoptosis via Akt/iNOS/NO pathway

SUNXiao-ting1,JIANGXi2,PANGLei1,etal.

(1.DepartmentofAnesthesiology,2.HealthManagementCenter,TheFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To explore the potential relationship and mechanism between cyclooxygenase-2 (COX-2) expression and apoptosis during myocardial ischemia /reperfusion injury(MI/ RI).Methods We simulated the process of MI/ RI by hypoxia /reoxygenation (H/R) experiment in both H9C2 cell line and primary rat cardiomyocytes,and detected the expression of COX-2 and apoptosis-related protein.Furthermore,COX-2 expression was inhibited by NS398,COX-2 specific inhibitor.Changes of cell apoptosis were detected,and the underlying mechanism was explored.Results Pre-treatment with NS398 significantly attenuated H/R-induced cell injury and apoptosis [increased expression of Bcl2 and reduced level of cleaved caspases-3 and TUNEL-positive cells] in cardiomyocytes.Conclusion In cardiomyocytes,H/R stimulation will activate COX-2 expression and induce cell damage through apoptotic pathway.Inhibition of COX-2 will protect cardiomyocytes against apoptosis via Akt/iNOS/NO signaling pathway.

COX-2；myocardial ischemia/ reperfusion injury (MI/ RI)；hypoxia/reoxygenation (H/R)；cardiomyocytes,apoptosis

吉林省教育廳135計劃(2014-471)；吉林大學(xué)研究生創(chuàng)新基金資助項目(2016226)；吉林大學(xué)第一院第七屆青年基金(JDYY72016023)

1007-4287(2017)02-0290-05

R541

A

2016-09-25)

*通訊作者