產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的檢測及感染現(xiàn)狀

劉希華，鐘太清，朱元琪，蘇維奇*

(1.海軍青島第二療養(yǎng)院 感控科，山東 青島266071；2.青島大學附屬青島市立醫(yī)院 檢驗科；3. 青島大學附屬醫(yī)院 檢驗科)

*通訊作者

產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的檢測及感染現(xiàn)狀

劉希華1，鐘太清2，朱元琪3，蘇維奇2*

(1.海軍青島第二療養(yǎng)院 感控科，山東 青島266071；2.青島大學附屬青島市立醫(yī)院 檢驗科；3. 青島大學附屬醫(yī)院 檢驗科)

目的 通過對碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)的檢測及病例分析，了解CRKP對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制及感染現(xiàn)狀，為臨床抗感染治療及院感控制提供依據(jù)。方法 應用BD phoenixTM-100 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)篩選耐亞胺培南或美羅培南的肺炎克雷伯菌，然后通過改良Hodge試驗檢測碳青霉烯酶表型，用PCR方法檢測KPC、NDM-1和OXA-48碳青霉烯酶耐藥基因。結(jié)果 71株CRKP改良Hodge試驗陽性56株，陽性率為78.9%，PCR結(jié)果顯示：71株CRKP中有53株檢測出blaKPC-2基因、8株blaNDM-1基因、2株blaOXA-48基因；標本來源主要見于ICU、腎內(nèi)科和神經(jīng)內(nèi)科等病房的痰液、尿液和引流液標本；藥敏結(jié)果顯示：所分離的71株CRKP除了對阿米卡星、替加環(huán)素和多粘菌素的耐藥率較低外，對其他抗菌藥物的耐藥率均>70%。 結(jié)論 CRKP臨床分布較為廣泛，多藥耐藥嚴重，其耐藥基因以產(chǎn)KPC-2型為主，但同時還出現(xiàn)了NDM-1和OXA-48基因型，應加強監(jiān)控。

肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；耐藥；感染

(ChinJLabDiagn,2017,21:0225)

碳青霉烯類抗菌藥物因其具有抗菌譜廣、抗菌活性高等特點，被認為是治療革蘭陰性桿菌最有效的藥物之一。然而，隨著臨床上該類藥物的廣泛應用甚至是不合理使用等原因，導致耐碳青霉烯類抗菌藥物的細菌種類及檢出率逐漸增多，特別是碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌(carbapenemresistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)的產(chǎn)生，不僅其耐藥范圍廣泛，而且可引起醫(yī)院內(nèi)的暴發(fā)流行[1]，給臨床抗感染治療帶來了很大困難，已成為全球共同關注的社會衛(wèi)生問題。本文對近三年來收集的71株CRKP的耐藥性及耐藥基因進行檢測，探討CRKP的耐藥機制及感染現(xiàn)狀，為臨床抗感染治療以及醫(yī)院內(nèi)感染的控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集本地區(qū)2013年1月-2015年12月青島大學附屬醫(yī)院、青島市市立醫(yī)院臨床分離的CRKP共71株。

1.2 主要儀器和試劑 美國BD公司phoenixTM-100 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)及配套試劑；美國Bio-Rad公司PCR擴增儀、全凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 細菌鑒定及藥敏試驗 所有菌株均采用美國BD公司phoenixTM-100 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進行檢測，結(jié)果判定依據(jù)美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI-2014)進行。質(zhì)控菌株為：大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.3.2 碳青霉烯酶表型檢測 采用改良Hodge試驗，將大腸埃希菌ATCC 25922配制0.5麥氏濁度菌液，再稀釋10倍，將稀釋后的菌液用無菌棉簽蘸取均勻涂布于M-H瓊脂平皿上，干燥3-10 min，將美羅培南紙片貼于M-H瓊脂平皿中央，用接種環(huán)挑取3-5個待測菌落，從紙片邊緣垂直劃線，長度約20-25 mm，孵育16-20 h觀察結(jié)果，如果待測菌株與大腸埃希菌ATCC 25922抑菌圈交匯處呈矢狀生長現(xiàn)象，即為產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.3.3 碳青霉烯酶基因擴增 PCR擴增blaNDM、blaKPC和blaOXA-48基因，參照文獻[2]進行，擴增的反應體系、條件、基因引物和產(chǎn)物長度見表1和表2。

表1 PCR擴增blaNDM、blaKPC和blaOXA-48基因引物和產(chǎn)物長度

表2 擴增blaNDM、blaKPC和blaOXA-48反應體系及條件

2 結(jié)果

2.1 CRKP的臨床分布及標本種類 71株CRKP主要分布于ICU、腎內(nèi)科和神經(jīng)內(nèi)科等病房，分別占53.5%、11.3%和7.0%；標本種類主要見于痰液、尿液和穿刺引流液，分別占62.0%、16.9%和9.9%。

2.2 藥敏試驗結(jié)果 71株CRKP除了對阿米卡星、替加環(huán)素和多粘菌素的耐藥率較低，分別為18.3%、11.3%和12.7%外，對其他臨床常用抗菌藥物如頭孢菌素類、加酶抑制劑類、喹諾酮類以及碳青霉烯類等表現(xiàn)出高耐藥性，耐藥率均大于70%。改良Hodge試驗 對篩選出的71株CRKP進行改良Hodge試驗，陽性56株，陽性率為78.9%。

2.3 耐藥基因檢測結(jié)果 71株CRKP經(jīng)PCR擴增及測序確認有53株為KPC-2型碳青霉烯酶，占74.6%；8株為NDM-1型酶，占11.3%；2株為OXA-48型酶，占0.03%，部分PCR擴增產(chǎn)物電泳圖見圖1。

注：M：DNA標準分子量；1-7：臨床分離株；P：blakpc-2陽性對照；N：陰性對照

圖1blaNDM、blaKPC和blaOXA-48基因多重PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

3 討論

肺炎克雷伯菌是引起醫(yī)院獲得性感染和社區(qū)獲得性感染的常見病原菌之一，常可引起呼吸道感染、尿路感染和血流感染等。中國細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)(CHINET)數(shù)據(jù)顯示，2011年至2016年肺炎克雷伯菌的分離率一直位于第二位，其中CRKP的檢出率由2011年的9%上升到2016年的19%，6年中檢出率增加了1倍多，其上升速度較快，并且CRKP大多表現(xiàn)為多重耐藥甚至是廣泛耐藥。目前，細菌耐碳青霉稀類藥物的機制主要有：①產(chǎn)碳青霉烯酶，主要包括A類和B類，A類中最多見的是KPC型碳青霉烯酶，B類碳青霉烯酶即為金屬酶，常見的有VIM、IPM以及近年報道的NDM-1型。②外膜蛋白的缺失聯(lián)合產(chǎn)AmpC酶，③藥物作用靶位的改變和藥物外排機制等。KPC酶是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型碳青霉烯酶，目前已發(fā)現(xiàn)有5個KPC亞型，國內(nèi)KPC酶主要為KPC-2型[3.4]，而李天驕[5]報道的海南省海口地區(qū)碳青霉烯酶主要為金屬酶，說明碳青霉烯酶基因型存在著地區(qū)差異，不同地區(qū)不同醫(yī)院可有不同的基因型。本試驗在71株CRKP中，共檢測出53株為KPC-2型碳青霉烯酶，占74.6%；8株為NDM-1型酶，占11.3%；2株為OXA-48型酶，占0.03%，其中還發(fā)現(xiàn)同時攜帶 blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因的肺炎克雷伯菌臨床株[10]，應引起高度重視。

改良的Hodge試驗敏感度較高，可用于對疑是產(chǎn)碳青霉烯酶細菌進行表型確證，但是，楊啟文[6]和Pasteran[7]等認為改良的Hodge試驗雖然靈敏度高，但特異性尚顯不足，可出現(xiàn)假陽性。其主要原因為出現(xiàn)假陽性的菌株產(chǎn)生了較多的ESBL或AmpC酶，影響了結(jié)果的判斷，提醒實驗室工作人員在實際工作中加以注意。

CRKP感染患者往往基礎疾病較多，全身免疫力低下，目前尚無有效的治療藥物，因此CRKP感染已成為院內(nèi)死亡的獨立危險因素[8]。劉靜嫻[9]等報道的60名CRKP感染患者中，好轉(zhuǎn)率僅有31.7%，直接死亡率達56.7%，另有11.6%的患者轉(zhuǎn)院或放棄治療。本試驗中的71株CRKP主要來源于重癥監(jiān)護室、腎內(nèi)科和神經(jīng)內(nèi)科的呼吸道、尿液和引流液等標本，可能與這些患者基礎疾病嚴重、住院時間較長、使用大量抗菌藥物及進行侵入性操作有關。

產(chǎn)KPC酶菌株不僅對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，同時可對頭孢菌素類、喹諾酮類等多種抗菌藥物廣泛耐藥。多重耐藥甚至是泛耐藥的CRKP感染是導致治療失敗和患者死亡的重要原因。本試驗藥敏結(jié)果顯示，71株CRKP除了對阿米卡星、替加環(huán)素和多粘菌素的耐藥率較低，分別為18.3%、11.3%和12.7%外，對其他臨床常用抗菌藥物如頭孢菌素類、加酶抑制劑類、喹諾酮類以及碳青霉烯類等表現(xiàn)出高耐藥性，耐藥率均大于70%。因此實驗室應做好檢測工作，一旦確定碳氫酶烯類耐藥的腸桿菌科細菌(CRE)，應作為危急值及時報告給臨床和院感管理部門，并及時采取控制措施，以減緩耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播。

[1] 趙 輝，賈 楠，徐 茶，等.產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌引起的新生兒感染及其同源性檢測[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2016,26(10)：2357.

[2]Poirel L,Walsh TR,Cuvillier V,et al.Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes[J].Diagnostic microbiology and infectious disease,2011,70(1): 119.

[3]俞 剛，張 肖，沈 靜，等.耐碳青霉稀類腸桿菌科細菌KPC和NDM-1內(nèi)酰胺酶耐藥基因的研究[J].中國感染與化療雜志，2014,14(1)：38.

[4]張翼霞，劉穎梅，陳宏斌，等.我國產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌的基因型及流行病學研究[J].中華內(nèi)科雜志，2014,53(2)：116.

[5]李天驕，王旭明，符生苗，等.海南產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶腸桿菌科細菌的流行現(xiàn)狀[J].廣東醫(yī)學，2014,35(14)：2204.

[6]楊啟文，鄭 瑞，王 輝，等.改良Hodge試驗檢測腸桿菌科細菌碳青霉烯酶的性能評價[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2010,33(12)：1122.

[7]Pasteran F,Mendez T,Rapoport M,et al.Controlling False-positive results obtained with the Hodge and Masuda assays for detection of class a carbapenemase in species of Enterobacteriaceae by incorporating boronic acid[J].J Clin Microbiol,2010,48(4):1323.

[8]Schwaber MJ,Klarfeld-Lidji S,Navon-Venezia S,et al.Predictors of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae acquistion among hosoitalized adults and effect of acquisition on mortality[J].Antimicrob Agents Chemother,2008,52(3):1028.

[9]劉靜嫻，俞 靜，李媛睿，等.肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制研究[J].上海交通大學學報 醫(yī)學版,2016,36(1)：93.

[10]油麗萍，陳愛文，秦 萍，等.首例同時攜帶blaNDM-1、blaKPC-2、blaDHA-1、blaTEM-1和blaOXA-1基因的肺炎克雷伯菌臨床株[J].中國實驗診斷學，2015,19(5)：744.

Detection of Klebsiella pneumoniae producing KPC carbapenemase and its infection status

LIUXi-hua,ZHONGTai-qing,ZHUYuan-qi,etal.

(NavyQingdaosecondnursinghomeInfectioncontrolsection,Qingdao266071,China)

Objective Detection and analysis of cases to carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae (CRKP).Understanding the resistance mechanism and infection status of CRKP antibacterial to carbopenems.Provide the basis for the clinical anti infection treatment and hospital infection control.Methods The application of BD phoenixTM-100 automatic bacteria identification and drug sensitivity analysis system for screening of Klebsiella pneumoniae resistant to imipenem or meropenem,and then through the modified Hodge test for the detection of carbapenemases phenotype of carbapenems.KPC,NDM-1 and OXA-48 carbapenemase resistancegene detected by PCR.Results 71 strains of CRKP modified Hodge test,56 were positive,the positive rate was 78.9%.PCR showed that there were 53 strains in 71 strains CRKP detect blaKPC-2 gene,8 strains blaNDM-1,2 strains blaOXA-48 genes;Specimen source mainly in urine ,sputum and drainage fluid which from ICU,renal medicine and neurology ward.The drug sensitivity results showed that in addition to the low resistance to amikacin,tigecycline and polymyxin,71 strains of isolates were resistant to other antimicrobial agents>70%.Conclusion CRKP clinical distribution is more extensive,multi drug resistance is serious.Resistance gene is mainly produced KPC-2,NDM-1 and OXA-48 also appeared at the same time.We should strengthen the monitoring with them.

Klebsiella pneumoniae;Carbapenemases;drug resistance;infection

1007-4287(2017)02-0225-03

R446.5

A

2016-02-26)