病原真菌中MAPK信號通路的研究進展

劉 帥，陳 晨?

（蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅 蘭州 730070）

病原真菌中MAPK信號通路的研究進展

劉 帥，陳 晨

（蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅 蘭州 730070）

信號通路對于細胞生理指標變化具有調控功能，不同的信號通路對于細胞行為的影響是不同的。綜述了MAPK信號通路在形態建成、細胞生長、胞壁合成以及應答壓力等方面的重要作用，并從HOG途徑、Mkc1途徑、Cek1和Cek2途徑，以及Fus3/Kss1-MAPK信號通路和Slt2-MAPK級聯通路等方面闡述了MAPK信號通路的研究進展。

病原真菌；MAPK信號通路；細胞行為；研究進展

信號通路是指能將胞外的信號經細胞膜傳入胞內的一系列酶促反應通路。胞外信號通過信號通路傳導至胞內，使胞內產生一系列生理生化變化，進而引起整個生物體的應答反應。細胞膜上存在著感知外界信號的受體，受體識別胞外信號后，使跨膜蛋白等相關蛋白上的保守氨基酸殘基磷酸化或去磷酸化，進而引起逐級級聯，將胞外信號按類別分別傳遞到不同的信號通路上，激活效應蛋白產生各種生理效應。此外，真菌可依靠特定的信號通路控制相關基因的表達，從而影響孢子形成、營養感知及形態建成等生物學過程。因此，對于真菌信號通路方面的研究有著重要的意義。

白念珠菌是常見的機會致病菌，主要侵襲和感染機體口腔黏膜、消化道等處，若人體免疫低下時可引發系統性感染，累及多個臟器[1]。典型的病原真菌有玉米大斑病菌、小麥條銹菌及稻瘟病菌等，這些通常會引起一些病害如條斑病、小麥條銹病、稻瘟病等，在農業生產上常常造成不可估量的損失。白念珠菌和各種病原真菌致病機理均涉及多條信號通路，其中受體酪氨酸激酶及RTK-Ras蛋白信號通路下游的MAPK級聯通路至關重要，現選取白念珠菌和病原真菌中的MAPK級聯通路作簡要綜述，以期為相關研究提供有益參考。

1 MAPK級聯通路概述

MAPK是一類普遍存在于真核生物中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要涉及細胞的信號傳導[2]。該信號通路是近年來的研究熱點之一，主要元件有MAPKKK（促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶）、MAPKK（促分裂原活化蛋白激酶激酶）、MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）。作用模式為：外界信號→RTK-Ras蛋白→MAPKKK→MAPKK→MAPK→改變基因表達模式及細胞行為。在真菌的交配、菌絲侵染、附著胞形成、細胞壁完整性、脅迫反應和致病毒力等方面起到非常重要的作用。常見的MAPK級聯通路有念珠菌中的HOG途徑、Mkc1途徑、Cek1途徑和Cek2途徑。在病原真菌中還存在Fus3/Kss1-MAPK信號通路和Slt2-MAPK級聯通路等[3]。

2 MAPK級聯通路在不同領域的研究進展

2.1 HOG途徑

在白念珠菌中存在高滲透性甘油促分裂原活化蛋白激酶信號轉導途徑（High-osmolarity glycerol mitorgen-activated protein kinase pathway，簡稱HOG途徑）。該途徑的主要作用是調控細胞滲透壓、控制細胞形態轉換以及促進細胞壁的合成等[4]。HOG途徑在真菌和哺乳動物中廣泛存在，是適應性應答外界壓力的經典途徑之一。該途徑分為兩部分：（1）上游兩條感應滲透信號的分支Sln1p、Sho1p；（2）下游保守的三級激酶級聯系統。

2017年，張楠等[5]研究發現，Sho1（synthetic high osmolarity-sensitive protein1）是HOG途徑上游的一個重要感受器，在不同真菌中常具有不同的功能。在膠孢炭疽菌中獲得Sho1同源基因CgSho1。利用同源重組獲得該基因的突變型菌株，發現突變型菌株表現出營養生長緩慢、產孢量下降、菌絲稀疏、對氧化壓力和滲透壓敏感性增強等特征，致病力明顯減弱。因此，研究認為CgSho1參與調控膠胞炭疽菌的營養生長、分生孢子產量、氧化應激反應、滲透壓響應及致病性等生理過程。

研究橡膠樹白粉病菌時發現，Pbs2是MAPK信號通路HOG途徑的重要成員之一，在植物病原菌滲透壓調節方面發揮著重要作用[6]。采用同源克隆的方法，對OhPbs2基因進行擴增，隨后進行生物信息學及系統進化分析，并利用同源重組和原生質體轉化技術將該基因轉化到橡膠樹炭疽菌突變體中，最后用橡膠樹葉片檢測其致病力。結果表明，OhPbs2可能在病菌營養生長、氧化應激反應、滲透壓響應及細胞壁形成等方面具有調控作用，同時對橡膠樹炭疽病菌的致病力有著增強作用。

在細胞周期進程的研究中發現[7]，HOG途徑中的Hog1在氧化應激時被激活。過氧化氫可以引起細胞周期G1期的瞬時停滯。盡管Hog1 MAPKs的磷酸化可在細胞周期的所有階段發生，但觀察發現該生理過程在G1期停滯之時更加明顯。與野生型細胞相比，hog1突變體的磷酸化需要更長的時間，目的是為了便于過氧化氫攻擊后細胞的恢復。此外，有過氧化氫存在的條件下，Hgc1（菌絲特異性G1細胞周期蛋白）和Cln3在hog1突變體中表現出不同的表達動力學。這些結果均表明，Hog1不僅響應于氧化應激反應，而且在標準條件下可調節G1細胞周期蛋白的表達，同時還介導響應氧化應激的細胞周期。

2012年，皇幼明等[8]對隱球菌中MAPK途徑進行了研究，對于HOG通路而言，主要在應對高滲壓力方面起作用，滲透壓正常時Hog1基因處于去磷酸化狀態，若外界存在高滲壓力，則該基因發生磷酸化。此外，該基因磷酸化還與隱球菌的毒力相關。

2.2 Mkc1途徑

Mkc1途徑又稱細胞完整性途徑，與釀酒酵母中的Slt2/Mpk1屬于同一家族。在白念珠菌中，該途徑的調節部分依賴于完整的HOG途徑；與突變型細胞相比，野生型細胞表面的甘露聚糖含量存在差別。此外，國外的相關研究觀察到一種缺乏p型ATP酶的pmr1突變型菌株，在Mkc1途徑處于持續的激活狀態時，其細胞表面成分發生了顯著變化。這進一步證實Mkc1途徑在細胞完整性中的作用[9]。另有研究表明，紅細胞中存在Hsp90（熱激蛋白90）這種保守的分子伴侶，Hsp90的減少導致Mkc1的不穩定，并且影響Mkc1的激活[10]。Hsp90長期影響細胞的Mkc1、HOG等途徑，進而使得細胞適應外界溫度，同時對細胞壁重塑過程有調節作用[11]。

國外科研工作者在細胞壁方面的研究指出，酵母細胞壁具有葡聚糖和幾丁質構成的基質，可提供拉伸強度和剛性[12]。隨著時間和環境的改變，酵母細胞也發生了變化，這是由保守的細胞完整性（Mkc1）信號通路控制的過程。這些MAPK通路調節基因表達，導致新細胞壁的構建。研究發現，在乳酸鹽中生長的白念珠菌細胞比在葡萄糖中生長的細胞更耐高滲，并且這種耐性的升高不依賴于Mkc1途徑，而大多數細胞死亡發生在滲透壓休克的10 min內。細胞體積的突然變小驅動著細胞壁厚度的快速增加。在乳酸鹽中生長的細胞，其抗壓性與細胞壁彈性相關，體現在高滲發生后細胞體積的變化上；同時，其細胞壁交聯酶的Crh家族失活，導致細胞對高滲性休克的敏感性增加。而在葡萄糖中生長的細胞，過表達Crh家族成員使細胞壁彈性降低，以防止高滲性休克，為細胞提供部分保護，同時這些變化與細胞壁結構重排的能力相關。

2.3 Cek1途徑和Cek2途徑

Cek1途徑的作用包括菌絲發生、形態建成和微生物毒力的控制。Cek1活化MAPK通路的轉錄因子Cph1，Cph1的識別模序是TGAAACA[13]。利用系統敲除，Maiti等[14]證明了Cph1的N端結構為結合DNA功能區域，而C端結構和多聚尾模序（PQ）與轉錄活性相關。Cph1基因組分析、結合位點分析等表明，Cph1的轉錄靶點是與線粒體功能以及維持細胞壁結構有關的基因和pH值應答通路的基因[14-16]。

在口咽念珠菌病（OPC）的研究中發現，菌株通過MAP激酶活化來感知周圍環境，MAP激酶還可調節一些抗真菌物質的活性，典型的如口腔分泌的殺菌蛋白Hst5[17]。研究發現，N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）或血清通過缺失其磷酸酶Cpp1進行活化，會使白色念珠菌細胞的易感性升高。OPC需要cek1磷酸化以增加對Hst 5的敏感性。通過刪除傳感器蛋白質Msb2和Sho1或其他途徑來干擾Cek1途徑，在cek1誘導條件下降低Hst5的敏感性。以上結果表明，Cek1 MAPK的活化與白色念珠菌Hst5敏感性增加之間存在一定的關聯。

Francois等發現，Hsp21（熱激蛋白21）介導的適應性反應通過調節群體平衡，促使Cek1磷酸化從而適應環境壓力[18]。在培養基中稀釋穩定期細胞，觀察到在隨后1～2 h內Cek1磷酸化過程出現峰值，提示MAPK信號通路可由生長信號調節。在此之中，Sho1銜接蛋白控制Cek1的激活，Sho1分支的opy2跨膜蛋白觸發Cek1磷酸化，使細胞恢復到穩定生長的階段，且使得干擾細胞壁合成的化合物增加[19]。因此，認為Cek1通路的上游序列可能是信號傳導調控的關鍵部位[20]。

Cek2途徑主要參與菌絲配對的信號傳導。CEK2基因與釀酒酵母中交配途徑FU53基因具有55%的同源性[4]。有研究證實，CEK2基因對于釀酒酵母fus3/kss1缺失株所產生的交配缺陷具有互補作用[21]，因此Cek2途徑對于菌絲配對的信號傳導起著重要作用。

2.4 Fus3/Kss1-MAPK信號通路

Fus3/Kssl-MAPK與病原真菌的交配、菌絲生長侵染、孢子生成及致病性相關。以綠僵菌為研究對象[22]，鑒定了Fus3/Kssl的MAPK基因MaMk1（GenBank登錄號EFY93607）所編碼的YERK1亞家族成員。通過構建MaMk1基因的突變株來研究其在真菌生長、分生孢子產量等方面的功能。結果表明，MaMk1是綠僵菌維持其致病力所必需的。基因表達模式分析顯示，MaMk1下調Mad1和Mpl1的表達，但不能降低綠僵菌中Pr1的表達。

在針對小麥條銹菌的研究中[23]，首先確定和表征了小麥條銹菌中的第一個MAPK基因PsMAPK1。系統發育分析揭示，PsMAPK1是屬于Fus3/Kssl類的YERK1 MAP激酶。實時RT-PCR分析顯示PsMAPK1的表達在早期感染階段被誘導。此外，禾谷鐮刀菌和稻瘟病菌可以用作小麥條銹菌基因功能分析的替代系統。同時，PsMAPK1可能還在滲透和感染生長中發揮作用。

為了明確玉米彎孢葉斑病菌中Fus3/Kss1-MAPK級聯途徑的作用，對其全基因組中的Fus3/Kss1-MAPK級聯途徑的相關基因進行鑒定，并且進行了生物信息學分析[24]。從中鑒定出3個蛋白激酶基因Clf、Map2k、Clk1和一個錨定蛋白基因ClSte50。通過蛋白序列和進化樹等方面的分析，發現它們分別與其他植物病原真菌Fus3/Kss1-MAPK途徑中的激酶蛋白和錨定蛋白具有相似的結構特征和保守結構域，存在較高的同源性。同時，還發現相關蛋白激酶Map2k、Clk1、Clf和錨定蛋白Clste50與其他真菌中的相關蛋白結構相似，這表明它們可能具有類似的功能。

2.5 Slt2-MAPK級聯通路

Slt2-MAPK級聯通路是與植物病原真菌的細胞壁完整性相關的1條MAPK信號通路[2]，在釀酒酵母和白念珠菌中調節其交配、絲化和毒力[8]。為構建玉米大斑病菌中的MAPK級聯途徑模型，鞏校東等[25]從全基因組水平對玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）進行了MAPK超基因家族鑒定，結果發現基因組中存在4個MAPK基因，系統進化分析將其分為Kss1/Fus3、Slt2、Hog1 及 Ime2總共4 類，這些為深入解析植物病原真菌MAPK相關超家族奠定了基礎。

Pujol-Carrion等[26]研究單硫基谷氧還原蛋白時發現，單硫基谷氧還原蛋白Grx3和Grx4與MAP激酶Slt2相互作用，形成參與細胞對氧化應激的復合物。Slt2可獨立地結合Grx3或Grx4蛋白形成鐵/硫橋連簇。氧化應激條件下，激酶Slt2發生磷酸化，同時半胱氨酸配體中的突變體表現出活性，證明這些相互作用與氧化反應相關。

在Slt2-MAPK同源基因蛋白序列和功能分析中發現，該級聯通路相對保守，并且對致病力有影響。例如炭疽病菌的slt同源基因MAF1在菌株侵染植物形成附著胞的初期有作用[27]。麥角菌的mk2在侵染過程中穿透植物表皮時有重要作用，而其突變株對植物的侵染能力則有限[28]。

Mps1是稻瘟病菌中第1個被描述的Slt2-MAPK級聯通路中的MAPK[29]。Mps1敲除后，稻瘟病菌雖然可以形成附著胞，但卻不能侵染，同時菌株在植物組織內不能繁殖。研究Mps1敲除菌株的細胞壁時發現，突變體的細胞壁強度變弱，對真菌細胞壁降解酶的敏感度增強，且一段時間后出現菌絲自溶現象。上述結果表明，雖然Mps1基因敲除菌株可以正常生長，但會影響菌株細胞壁的強度及完整性，這也從側面反映了Slt2-MAPK級聯通路在細胞壁完整性中的作用。

3 總結與展望

MAPK信號通路在形態建成、細胞生長、胞壁合成以及應答壓力等方面起著至關重要的作用。對于真菌MAPK信號通路的研究，目前取得了不少研究成果，如HOG途徑主要與抗滲透壓、形態轉換以及胞壁的合成等相關；MKc1途徑主要在細胞完整性方面起作用；Cek1途徑的作用主要包括形態發生、菌絲形成以及致病力的控制等；Cek2途徑主要參與菌絲配對的信號傳導；Fus3/Kssl-MAPK信號通路主要是控制菌絲生長和侵染、交配以及孢子形成等；Slt2-MAPK級聯通路是與胞壁完整性相關的信號通路，在釀酒酵母和白念珠菌中還可調節交配、絲化和毒力等。在信號轉導過程中，不同通路間存在精確隔離性，進而保證不會導致信號傳遞紊亂，但是各個途徑之間還存在交叉協同作用。

目前，對于MAPK信號通路的研究雖然取得了較大成果，但仍然需要更多的試驗來探究其作用的深層次原理。例如，MAPK信號通路與白念珠菌毒力的相關性依然是未來研究的熱點。同時，采用分子生物學手段克隆出相關基因，并且利用生物信息學方法對這些基因進行分析，可以對病原真菌的致病原理做出進一步解釋，為攻克相關難題提供理論支持。

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Advances?in?MAPK?Signaling?Pathway?in?Pathogenic?Fungi

LIU Shuai，CHEN Chen
（College of Chemistry and Bioengineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, PRC）

Signal pathways have regulatory functions for changes of cell physiological indexes, and the effects of different signaling pathways on cell behavior are different. The important roles of MAPK signaling pathway in morphogenesis, cell growth, and cell wall synthesis and response pressure were reviewed. Advances in MAPK Signaling Pathway in Pathogenic Fungi were summarized from HOG pathway, Mkc1 pathway, Cek1 and Cek2 pathway, and Fus3/Kss1-MAPK signaling pathway and Slt2-MAPK China Unicom and other aspects.

pathogenic fungi; MAPK Signaling pathway; cell behavior; research progress

Q936

A

1006-060X（2017）11-0119-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.011.032

2017-09-08

國家自然科學基金（31560003）

劉 帥（1992-），男，山東濱州市人，碩士研究生，主要從事資源與環境微生物研究。

（責任編輯：成 平）