手性藥物分析方法研究進展

?鐘春素 ，楊 華 ?

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學植物科學實驗教學示范中心，湖南 長沙 410128）

手性藥物分析方法研究進展

鐘春素1，楊 華2

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學植物科學實驗教學示范中心，湖南 長沙 410128）

從手性藥物的概念入手，闡述了高效液相色譜法、毛細管電泳法、分子印跡技術、高速逆流色譜法、超臨界流體色譜法和生物酶法等幾種常用的手性藥物分析技術的原理、特點及研究實例，以期為手性藥物分離技術提供指導。

手性藥物；分離；色譜法；研究進展

目前，40%～50%的藥物具有手性。而手性藥物的2種不同對映體的生物活性存在較大差異，一個可能是有效成分，而另一個可能是低效甚至是有毒成分。在人體內，兩對映體也可發生相互轉化，這就導致了很多藥物服用之后出現副作用。因此，在對藥物進行理化性質分析的時候，手性藥物的分離技術發揮了重要作用。筆者從手性藥物的概念入手，闡述了近幾年常用的幾種手性藥物分析技術的原理、特點及研究實例，以期為手性藥物分離技術提供指導。

1 手性藥物概述

手性藥物即在藥物分子結構中引入手性中心所得到的一對互為鏡像與實物的對映異構體。目前，臨床上使用的藥物約有40%～50%是手性藥物。手性藥物的藥理可能有以下4種情況：（1）其中一個對映體具有預期的藥理活性，而另一個對映體卻不存在；（2）兩個對映體有類似或者接近的藥理活性；（3）兩對映體藥理活性不相同，而且其中一個有可能是其消旋體藥物副反應的根源；（4）兩對映體藥理活性相同但兩者作用強度不同[1]。在藥代動力學方面，手性藥物也可能在體內的吸收、分布、代謝和排泄中表現出一定程度的立體選擇性。因此進行手性藥物的分離以及質量控制、藥效評價具有很重要的意義。

2 手性藥物分析技術

2.1 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法自20世紀70年代興起以來便成為藥物分析最常用的方法之一。在拆分手性藥物對映體的應用中，HPLC法分為直接法和間接法，直接法是將不對稱中心引入分子間，包括手性固定相法和手性流動相添加劑法；間接法又稱手性試劑衍生化法，它與前者所不同的地方在于它是將不對稱中心引入到分子內部。

陳立云等[2]通過對照品法測定安立生坦的對映異構體，用Chiral-pakAD-H（4.6 mm×250 mm，5 μm）作色譜柱，正己烷-乙醇（95︰5）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為263 nm。結果表明，高效液相色譜法能使安立生坦與其對映異構體有效分離，且分離度達8.0以上，質量濃度在1.04～5.18 μg/mL之間有良好線性關系。

王麗娜等[3]使用正相高效液相色譜法，以DAICELOJ-H作手性柱，正己烷-乙醇-二乙胺為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長230 nm，柱溫維持30℃，進樣量20 μL，測定左舒必利原料中的雜質及其含量。結果表明，左舒必利的分離度在此實驗條件下為2.1，在1.648～16.48 μg/mL之間線性關系良好，檢測限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分別為0.099和0.198 μg/mL，通過該方法檢測得到3批原料中手性雜質含量為0.47%～0.50%。

鄭振等[4]采用反相高效液相色譜法，以環糊精作固定相分離抗抑郁藥米那普侖對映體。結果表明，經過多次拆分條件的優化，確定出采用乙?；?β-環糊精手性柱AstecCYCLOOBONDTMI2000AC作固定相，0.1%的乙腈（體積分數）和pH值5.0的醋酸三乙胺溶液為流動相，流速為0.4 mL/min，柱溫維持在25℃，檢測波長220 nm，米那普侖對映體能夠快速分離，且分離度達1.74。

2.2 毛細管電泳法（CE）

CE是20世紀80年代初期由傳統電泳技術與色譜技術結合發展起來的一門新技術。該技術操作簡便，分離模式多樣化，分離效率高。近年來被廣泛應用于醫藥科學、食品檢測、生命科學等領域。

付小帥等[5]采用手性選擇劑羧甲基-β-環糊精（CM-β-CD），以NaH2PO4緩沖溶液為電解質，采用未涂層熔融石英材料毛細管柱，在20 kV電壓下分離佐匹克隆、卡維地洛、普萘洛爾、氧氟沙星和尼卡地平5種堿性藥物對映體。結果表明，佐匹克隆等5種藥物在該試驗條件下對映體的分離度分別為5.7、6.2、5.0、9.8和3.0，說明CM-β-CD對佐匹克隆等5種手性藥物有較高的對映體選擇性。

董樹清等[6]采用超支化聚合物涂覆于表面的熔融石英作毛細管柱，以硼砂-氫氧化鈉為背景運行緩沖液，分離阿苯達唑亞砜等幾種手性藥物的基線。結果表明，超支化聚合物應用在毛細管電泳技術中能很好地實現手性藥物的分離，并且分離效率高。

孫嘉怡等[7]采用羧甲基-β-環糊精（CM-β-CD）作手性選擇劑，使用未涂層的石英毛細管柱，電解質為NaH2PO4緩沖溶液，在20 kV電壓下拆分羥氯喹、沙丁胺醇、氯苯那敏和班布特羅4種手性藥物。結果表明，羥氯喹、沙丁胺醇、氯苯那敏和班布特羅的分離度分別為6.79、1.56、10.49和3.75，說明CM-β-CD針對這4種手性藥物有很高的選擇性。

左莉華等[8]采用手性選擇劑硫酸化-β-環糊精（S-β-CD），以未涂壁石英材料作毛細管柱，背景電解質采用NaH2PO4緩沖溶液，在電壓為20 kV下拆分曲馬多、利阿唑、苯丙哌林、1-芐基-3哌啶醇和聯苯芐唑5種手性藥物。結果表明，5種藥物的分離度分別為6.10、2.80、10.41、5.50和4.09，說明S-β-CD對這5種手性藥物的選擇性較高。

2.3 分子印跡技術（MIT）

分子印跡技術是一種通過設計合成對目標分子（如藥物等）具有親和力和特異選擇性的分子印跡聚合物的技術，該技術的發明啟發于抗原-抗體的專一性識別。因分子印跡聚合物（MIPs）具有構效預定性、特異性、穩定性、適用廣泛性和結合能力高等特點，在諸多領域得到廣泛應用[9]。

邴乃慈等[10]以4-乙烯基吡啶為功能單體，通過支撐膜聚偏氟乙烯中空纖維超濾膜和模板分子S-（+）-萘普生設計合成分子印跡復合膜，采用紫外光譜法研究了目標分子與模板分子之間的相互作用。結果表明，分子印跡聚合物膜中存在著與模板分子互補的三維空間結構以及由功能基的孔穴組成的通道，該通道能夠選擇性地透過S-（+）-萘普生，在親和力和壓力的共同作用下，最大分離因子達到6.19。

趙瀟等[11]采用S-布洛芬作印跡分子，接枝環糊精的醋酸纖維素復合物作鑄膜材料，通過相轉化法合成了具有手性拆分功能的分子印跡膜，并通過滲透試驗考察了所制備分子印跡膜對外消旋布洛芬的手性拆分效能。結果表明，在β-環糊精接枝率為29.01%（質量分數），模板分子濃度比為1︰10，鑄膜液質量分數為12.5%的條件下，分子印跡膜對右旋布洛芬的分離因子可達2.09。

2.4 高速逆流色譜法（HSCCC）

高速逆流色譜是利用高速旋轉的螺旋管內兩相溶劑體系建立起的一種特殊單向性流體力學平衡，兩相其中一相是固定相，另一相是流動相，經過連續洗脫過程能保留大部分固定相的分離方法，因其具有無污染、樣品無損失、高效、大制備量分離等特點而被廣泛應用。

Tong等[12]使用羥丙基-β-環糊精手性拆分甲氧萘丙酸，研究了對手性選擇性和分配系數均有影響的操作條件，即8種水相pH值及9種溶劑系統，最終挑選出最優的操作條件，最終藥品回收率達89%，并且拆分得到的單體純度高達99.5%以上。

沈芒芒[13]在分析型高速逆流色譜上采用N-n-十二烷基-L-脯氨酸作手性配體，銅離子作配位金屬，在正丁醇-正己烷-水三相溶劑體系或正丁醇-水兩相溶劑中實現了7種α-羥基酸類手性化合物的手性拆分，成功分離了76 mg 2-氯扁桃酸、74 mg 4-甲氧基扁桃酸和74 mg扁桃酸，并通過液相檢測，得出對映體的純度均超過96%，回收率在82%～90%之間。

謝娜[14]將水溶性手性萃取劑β-環糊精（β-CD）及其衍生物添加在水相中，將脂溶性手性選擇劑酒石酸酯類衍生物添加至有機相中，采用疏水性相轉移劑四苯硼鈉，通過HSCCC成功分離了苯基乳酸、酮康唑等外消旋物質。

2.5 超臨界流體色譜法（SFC）

超臨界流體色譜法是指采用超臨界流體作流動相的色譜法。20世紀60年代Klesper等[15]首次采用超臨界流體作色譜流動相分離了卟啉衍生物，超臨界流體色譜法也在此之后慢慢被發展起來。SFC兼具HPLC和GC兩種技術的優點，是一種分析難揮發及不耐熱的大分子化合物和生物試樣的有效方法。

戴濤等[16]考察了ChiralpakAD-H、ChiralpakAS-H、ChiralcelOD-H等5種手性柱的分離效果，并分析了分離度的影響因素，包括改性劑的種類、溫度、濃度及背壓。結果表明，采用ChiralpakAD-H柱、以異丙醇（占流動相比例為18%）為改性劑、背壓為14 MPa、溫度為29.85℃時，齊留通對映體達到最佳分離，分離度為11.5，兩對映體出峰時間分別為4.59、7.35 min。

金薇等[17]采用色譜柱ChiralcelOD，以超臨界二氧化碳-無水乙醇作流動相，流速為2.0 mL/min，背壓為15 MPa，在220 nm波長處分離測定左乙拉西坦及其右旋異構體。結果表明，左乙拉西坦與其右旋異構體依次出峰，分離度達3.7，兩者的濃度線性范圍在0.002～0.041 mg/mL之間，相關系數分別為0.999 5和0.999 4（n=7），檢測線均為10 ng（S/N=3）。

Chennuru等[18]采用新一代手性柱ChiralpakIA，ChiralpakIB及ChiralpakIC，在SFC和LC兩種分離模式下，對比6種質子泵抑制劑（蘭素拉唑、泮托拉唑、奧美拉唑、艾普拉唑、雷貝拉唑、泰妥拉唑）的對映選擇性。結果表明，在SFC和LC模式下，各對映異構體洗脫順序是相同的，3種新型手性柱的分離性能由低到高依次是ChiralpakIB＞ChiralpakIA＞ChiralpakIC。

2.6 生物酶法

生物酶法作用條件溫和，副反應少，產物分離純化簡便，污染及能耗均較低，且產物光學純度高，在手性藥物中間體的研發中應用非常廣泛[19]。

傅德進等[20]通過單因素優化及正交試驗確定了摩氏摩根菌的最佳產酯酶培養基配方，以摩氏摩根菌菌體作催化劑，選擇性地拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，目標物轉化率達45%，對映體的過量值超過94%，為酶法在普瑞巴林手性中間體生產中的應用打下了基礎。

于芳等[21]使用生物?；涪裼羞x擇性的將被乙酰化的外消旋3-溴苯丙氨酸進行去酰胺化，分離得到了互為異構體的溴代苯丙氨酸鹽酸鹽，并通過高分辨質譜、旋光值及核磁共振等數據進一步證實了該試驗結果的可靠性。結果表明，?；涪窨梢杂行糜诤迦〈谋奖彼嵫苌锏氖中圆鸱?。這為含有苯丙氨酸衍生物結構的天然產物分子和藥物分子的合成提供一個簡易可行的路線。

張之建等[22]以固定化脂肪酶為催化劑，以異丙醚為溶劑體系，底物采用乙酸乙烯，來拆分扁桃酸，當乙酸乙烯酯與扁桃酸摩爾濃度比為6，扁桃酸濃度為180 mmol/L，溫度為50℃時，乙酸乙烯的轉化率為50%，產物對應體過剩量和底物對應體過剩量超過99.9%。這表明脂肪酶對扁桃酸選擇性很高。

3 展 望

手性藥物的研究越來越受到重視，不同分析方法都具備各自的優勢，但也存在一些不足。例如HPLC法雖然是目前常用的方法但其手性固定相的成本太高，手性流動相添加劑使色譜條件變得較復雜；而GC法在藥物分析中對藥物的沸點要求嚴格，且其非對映體制備較困難等。為了彌補單一技術的不足，各種分離技術的聯合使用越來越多，在未來手性藥物拆分中將會發揮越來越顯著的作用。

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Advances?in?Analytical?Methods?of?Chiral?Drugs

ZHONG Chun-su1，YANG Hua2
（1. Biosience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. Demonstration Center of Plant Science Experiment Teaching , Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Based on the concept of chiral drugs, the principle, characteristics and research examples of several kinds of commonly used chiral pharmaceutical analysis technology were reviewed, which includes high-performance liquid chromatography (HPLC), capillary electrophoresis (CE), molecular imprinting technology(MIT), high-speed counter-current chromatography (HSCCC), supercritical fluid chromatography (SFC) and enzymatic method. All these may provide guidance for chiral drug separation technology.

chiral drug; separation; chromatography; research progress

R914.1

A

1006-060X（2017）11-0113-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.011.031

2017-09-13

湖南省科技計劃項目（2015RS4059）

鐘春素（1995-），女，廣東河源市人，本科生，生物工程專業。

楊 華

（責任編輯：成 平）