血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+聯合檢測對新生兒敗血癥的診斷價值

郭輝，葛亮，張思

(1.北京市豐臺婦幼保健院兒科，北京 100067；2.中國社會科學院研究生院研究生工作處，北京 102488；3.北京市豐臺婦幼保健院檢驗科，北京 100067)

血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+聯合檢測對新生兒敗血癥的診斷價值

郭輝1，葛亮2，張思3

(1.北京市豐臺婦幼保健院兒科，北京 100067；2.中國社會科學院研究生院研究生工作處，北京 102488；3.北京市豐臺婦幼保健院檢驗科，北京 100067)

目的探討聯合檢測血清降鈣素原(PCT)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、CD14+/CD16+水平對新生兒敗血癥的診斷價值。方法選取2012年9月至2015年12月期間我院確診的敗血癥新生患兒80例作為敗血組，同期選取健康新生兒40例作為健康組，采用流式細胞技術檢測CD14+/CD16+、免疫發光法檢測PCT、酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測TNF-α，采用ROC曲線評估新生兒敗血癥的診斷效能，統計分析所有受檢者的血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+水平及三者聯合檢測對新生兒敗血癥的診斷價值。結果敗血組患兒發病時血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+水平分別為(6.57±2.38)ng/mL、(28.69±8.13)pg/mL、(11.35±3.21)%，感染控制后分別為(1.63±0.67)ng/mL、(9.36±3.97)pg/mL、(8.23±2.27)%，健康組血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+水平分別為(0.86± 0.43)ng/mL、(6.29±2.01)pg/mL、(7.67±1.13)%，敗血組患兒發病時和感染控制后上述因子水平均明顯高于健康組，敗血組患兒感染控制后上述因子水平明顯低于發病時，差異均有統計學意義(P＜0.05)；ROC曲線顯示，血清PCT以1 ng/mL、TNF-α以7.5 pg/mL、CD14+/CD16+以8.5%為臨界值時，三者聯合檢測診斷新生兒敗血癥的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度及曲線下面積分別為93.75%(75/80)、92.50%(37/40)、96.13%(75/78)、88.10% (37/42)、93.33%(112/120)、0.836，與出生后實驗診斷基本相同，差異無統計學意義(P＞0.05)。結論血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+水平與新生兒敗血癥的發生發展有關，聯合檢測三者水平有利于醫師評估新生兒敗血癥的病情變化，且在診斷該疾病中具有良好的特異性、敏感性和準確性，可作為一種重要的診斷方法。

降鈣素原；腫瘤壞死因子-α；CD14+/CD16+；診斷；新生兒敗血癥；敏感性

新生兒敗血癥是臨床上常見的新生兒時期疾病之一，由致病菌或條件致病菌侵入血循環并在血中生長繁殖，產生毒素引起急性全身性感染所致，隨病情進展可由原發感染部位向身體其他重要器官(如心、腦、骨髓等)發展，引起轉移性膿腫，嚴重者可導致死亡的發生[1]。目前，新生兒敗血癥的治療關鍵在于及早發現、迅速控制，其最可靠的一種診斷依據為血培養，但血培養操作較為復雜、時間長等特點不利于及時診斷該疾病，難以滿足臨床需要，故尋找一種敏感性高、快速且有效的診斷方法成為了學者們重點關注的問題[2-3]。對此，本研究通過聯合檢測新生兒血清降鈣素原(PCT)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、CD14+/CD16+水平，探討其對新生兒敗血癥診斷敏感性及效能的影響，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年9月至2015年12月期間我院確診治療的敗血癥新生患兒80例作為敗血組，其中男性48例，女性32例；年齡1～16 d，平均(8.69±2.24)d；孕周32～40周，平均(37.18±3.73)周；出生體質量1 887～4 057 g，平均(3 287.46±326.43)g；血培養顯示36例皮葡萄球菌陽性，20例大腸埃希菌陽性，12例溶血性葡萄球菌陽性，12例肺炎克雷伯桿菌陽性。同期選取健康新生兒40例作為健康組，男性22例，女性18例；年齡1～17 d，平均(8.53±2.41)d；孕周32～41周，平均(37.86±3.92)周；出生體質量1 823～4 122 g，平均(3 386.18±335.81)g。兩組受檢者在性別、年齡、出生體重、孕周等一般資料方面比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 納入和排除標準 (1)納入標準：經臨床癥狀、病史、血尿常規、實驗室檢查(血培養)、CT或超聲檢查等證實為新生兒敗血癥[4]；無凝血系統嚴重性疾病；患兒家屬簽署知情同意書。(2)排除標準：伴有心、胃、腦等重要器官其他嚴重性疾病；有先天性免疫缺陷或免疫缺陷家族史；拒絕或中途退出本次研究者。

1.3 儀器和試劑 實驗室檢查：Bactec-9120血培養系統(美國Bactom Dickson公司)、細菌鑒定和藥敏試驗試劑(廣州兆康生物科技有限公司)；血清學檢測：Model D4Z-WS全自動離心分離機(淄博恒拓分析儀器有限公司)、PCT試劑盒(廣州健侖生物科技有限公司)、TNF-α試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)，全自動生化分析儀(日立7600-020)；流式細胞技術檢測：FACS Calibur流式細胞儀和Cellquest軟件及其配套試劑(Bactom Dickson公司)。

1.4 觀察指標與檢測方法 所有患兒入院或出生后和感染控制后給予早晨空腹處理，抽取上肢靜脈血6 mL置入無菌抗凝試管中，常規棉簽止血后進行相關檢查，所有操作均嚴格依據說明書及相關規定進行，統計分析所有研究對象血清PCT、TNF-α、CD14+/ CD16+水平。(1)實驗室檢查：取適量血液樣本立刻送往實驗室進行血液培養，即將樣本置入血培養箱后于培養瓶放置熒光感受器每10 min自動掃描1次，并由其模擬生長曲線，若5 d對數生長期儀器仍未警報(熒光呈對數無增加)視為無細菌感染(陰性，記-)，當對數生長期(熒光呈對數增加)儀器出現警報，提示有細菌生長視為有細菌感染(陽性，記+)，對警報樣本抽取培養液接種血平板、巧克力平板分別置35℃的CO2培養箱中培養24 h后進行細菌鑒定和藥敏試驗；(2)血清學檢測：將剩余血液樣本進行血清分離，3 000 r/min，持續12 min，取上清液平均置入無菌試管A(用于PCT檢測)、B(用于TNF-α檢測)，采用免疫發光法檢測PCT，采用ELISA法檢測TNF-α，通過全自動生化分析儀進行水平測定；(3)流式細胞技術檢測：再取適量血液樣本置入專用流式試管后滴加10μL的多甲藻葉綠素蛋白(Per CP)熒光素標記的鼠抗人CD45、異硫氰酸(FITC)熒光素標記的鼠抗人CD14、藻紅蛋白(PE)熒光素標記的鼠抗人CD16，靜置15 min后加入1 mL紅細胞裂解液，靜置10 min后離心棄上清液并加入2 mL生理鹽水，洗滌1次后以400 μL生理鹽水重懸細胞，通過流式細胞儀及其配套軟件進行水平測定。

1.5 統計學方法 應用SPSS20.0統計軟件進行數據分析，計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，采用ROC曲線分析聯合檢測血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+水平對新生兒敗血癥的診斷效能，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組受檢者的血清PCT、TNF-α、CD14+/ CD16+水平比較 敗血組患兒各時段血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+水平均明顯高于健康組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；敗血組患兒感染控制后血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+水平明顯低于發病時，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組受檢者的血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+水平比較(±s)

表1 兩組受檢者的血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+水平比較(±s)

注：與健康組比較，aP＜0.05；與敗血組感染控制后比較，bP＜0.05。

組別敗血組CD14+/CD16+11.35±3.21ab8.23±2.27a7.67±1.13 27.548＜0.05健康組F值P值時間發病時感染控制后入院時例數80 80 40 PCT(ng/mL) 6.57±2.38ab1.63±0.67a0.86±0.43 46.824＜0.05 TNF-α(pg/mL) 28.69±8.13ab9.36±3.97a6.29±2.01 34.279＜0.05

2.2 聯合檢測血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+診斷 新生兒敗血癥的ROC曲線ROC曲線結果顯示，血清PCT以1 ng/mL、TNF-α以7.5 pg/mL、CD14+/ CD16+以8.5%為臨界值時，三者聯合檢測診斷新生兒敗血癥的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度及曲線下面積分別為93.75%(75/80)、92.50% (37/40)、96.13%(75/78)、88.10%(37/42)、93.33%(112/ 120)、0.836，見圖1。

圖1 聯合檢測血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+診斷新生兒敗血癥的ROC曲線

2.3 不同方法對新生兒敗血癥的診斷效能比較 血清PCT以1 ng/mL、TNF-α以7.5 pg/mL、CD14+/ CD16+以8.5%為臨界值時，三者聯合檢測對新生兒敗血癥的診斷效能與出生后實驗診斷基本相同，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 不同方法對新生兒敗血癥的診斷效能比較（例）

3 討 論

敗血癥是新生兒一種常見的嚴重感染性疾病，可導致高熱、關節痛、肝脾大、休克等癥狀發生，由于新生兒免疫系統未成熟，免疫功能較差，其病情進展迅速且險惡，可引起全身廣泛炎性反應，甚至侵襲心、腦、骨髓等重要部位形成轉移性膿腫，危及患兒的生命安全[6]。新生兒敗血癥的早期臨床表現常不典型，其最可靠的診斷方法為血培養，但血培養所需時間較長難以滿足臨床需要，故如何準確、快速鑒別診斷該疾病對確保患兒生命安全具有重要的臨床價值[7-8]。

有研究顯示，新生兒敗血癥是由病原體侵入新生兒血液中并且生長、繁殖、產生毒素所致，在此過程中，可引起機體劇烈的炎癥反應，引起血清中多種炎癥因子的水平上升，通過檢測相應的炎癥因子可協助醫師進一步診斷該疾病的發生[9-10]。而PCT是機體內一種蛋白質，正常情況下處于血清低水平狀態，當嚴重細菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時可引起其在血漿中的水平劇烈上升，可作為一個急性的參數來鑒別診斷細菌性和非細菌性感染和炎癥；TNF-α則是機體內常見的一種細胞因子，可能由細菌內毒素刺激機體產生過量TNF-α，血漿中高濃度TNF-α刺激內皮細胞，同時可能通過促進吞噬細胞和內皮細胞產生IL-1等炎癥因子，導致炎癥、組織損傷，在炎癥反應中具有重要的作用[11-13]。而廖崇倫[14]以及郭大斌等[15]研究表明，新生兒敗血癥在發病過程中，可引起機體的免疫反應，引起體內多種免疫因子水平的增加來清除入侵的病原體，而單核巨噬細胞系統在機體的免疫防御中具有重要作用，其中CD14+、CD16+是常見的因子，正常狀態時CD14+/CD16+水平于單核細胞中占比低于10%，當機體出現免疫反應時，可刺激單核細胞分化，使CD14+/CD16+水平增加以刺激T淋巴細胞分化成熟，并成為具有免疫活性的T細胞來參與至免疫反應中。

對此，本研究發現敗血組患兒各時段血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+水平均明顯高于健康組，敗血組患兒感染控制后上述指標水平均明顯下降，而ROC曲線顯示，血清PCT以1 ng/mL、TNF-α以7.5 pg/mL、CD14+/CD16+以8.5%為臨界值時，三者聯合檢測診斷新生兒敗血癥的敏感度、特異度、準確度及曲線下面積分別為93.75%、92.50%、93.33%、0.836，與出生后實驗診斷基本相同，表明三者水平與新生兒敗血癥的發生發展有關，聯合檢測三者水平診斷該疾病具有良好的特異性、敏感性和準確性，可作為一種重要的診斷方法。本研究結果提示在新生兒敗血癥的發生過程中，可能由于病原體產生大量的毒素引起機體劇烈的炎癥反應，進而引起機體血清PCT水平的上升，同時還刺激機體產生過量TNF-α，導致炎癥、組織損傷，且由于機體受到病原體的入侵，可引起機體免疫系統做出相應的防御反應(免疫反應)，促使機體刺激單核細胞分化，使CD14+/CD16+水平于單核細胞中占比上升以刺激T淋巴細胞成為具有免疫活性的T細胞，進而使機體滅殺和清除機體內的病原體，故上述指標水平變化可在一定程度上反映新生兒敗血癥的發生，提示三者水平能敏感地反映細菌感染的情況，聯合檢測三者水平可作為診斷該疾病一種重要的方法。此外，敗血癥患兒在感染控制后，可能由于體內病原體已被有效滅殺和毒素已被有效清除，使機體炎癥反應和免疫反應緩解，故血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+水平下降，但可能由于未完全治愈，故三者水平仍處于較健康新生兒高的水平，提示三者水平與新生兒敗血癥的病情變化也具有較為良好的敏感性，可協助醫師評估患兒的病情，以指導制定相應的治療方案，有利合理用藥。

綜上所述，血清PCT、TNF-α、CD14+/CD16+水平與新生兒敗血癥的發生發展有關，聯合檢測三者水平有利于醫師評估新生兒敗血癥的病情變化，且在診斷該疾病中具有良好的特異性、敏感性和準確性，可作為一種重要的診斷方法，值得臨床作進一步推廣。

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Application value of combined detection of serum PCT,TNF-α,CD14+/CD16+levels in the diagnosis of neonatal sepsis.

GUO Hui1,GE Liang2,ZHANG Si3.1.Department of Paediatrics,Beijing Fengtai Maternal and Child Health Care Hospital,Beijing 100067,CHINA;2.Department of Postgraduate Administration,Graduate School,Chinese Academy of Social Sciences,Beijing 102488,CHINA;3.Department of Clinical Laboratory,Maternal and Child Health Care Hospital of Fengtai,Beijing 100067,CHINA

ObjectiveTo discuss the application value of combined detection of serum procalcitonin(PCT),tumor necrosis factor-α(TNF-α),CD14+/CD16+levels in the diagnosis of neonatal sepsis.MethodsEighty children with neonatal sepsis were selected from September 2012 to December 2015 in our hospitals as sepsis group,and 40 healthy newborns in the same period were selected as the healthy group.Flow cytometry was used to detect CD14+/ CD16+,and immune luminescence method was used to detect PCT.Enzyme-linked immunosorbent(ELISA)was used to detect TNF-α,and ROC curve to evaluate the diagnosis of neonatal sepsis.The value of serum PCT,TNF-α,CD14+/ CD16+level and the combined detection in the diagnosis of neonatal sepsis was analyzed.ResultsSerum PCT,TNF-α, CD14+/CD16+levels in sepsis group were respectively(6.57±2.38)ng/mL,(28.69±8.13)pg/mL,(11.35±3.21)%at attack, and(1.63±0.67)ng/mL,(9.36±3.97)pg/mL,(8.23±2.27)%after infection control,which were all significantly higher than those in health group of(0.86±0.43)ng/mL,(6.29±2.01)pg/mL,(7.67±1.13)%,P＜0.05.The levels after infection control in sepsis group were significantly lower than those at attack(P＜0.05).ROC curve showed that,with serum PCT 1 ng/mL,TNF-α 7.5 pg/mL,CD14+/CD16+8.5%as the critical value,the sensitivity of the combined detection for neonatal sepsis,specificity,positive predictive value,negative predictive value,accuracy and area under the curve(AUC) were 93.75%(75/80),92.50%(37/40),96.13%(75/78),88.10%(37/42),93.33%(112/120)and 0.836,which were almost the same as basic experimental diagnosis after birth,with no significant difference(P＞0.05).ConclusionSerum PCT, TNF-α,CD14+/CD16+levels are associated with the development of neonatal sepsis.Combined detection of three levels is helpful for doctors to assess change of disease condition,which has a good specificity,sensitivity and accuracy,and can be used as an important diagnostic method for neonatal sepsis.

Procalcitonin;Tumor necrosis factor-α;CD14+/CD16+;Diagnosis;Neonatal sepsis;Sensitivity

R722.13+1

A

1003—6350（2017）01—0083—04

2016-08-12)

北京市優秀人才培養項目(編號：20081A031000086)

郭輝。E-mail：117953412@sina.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.025