骨髓穿刺活檢組織快速處理的新方法

劉祿，楊娜，夏勤，夏娟，劉智，李林豐，張薇珊，羅啟翅，崔麗娟

(遂寧市中心醫院病理科1、檢驗科2，四川 遂寧 629000)

骨髓穿刺活檢組織快速處理的新方法

劉祿1，楊娜2，夏勤1，夏娟1，劉智1，李林豐1，張薇珊1，羅啟翅1，崔麗娟1

(遂寧市中心醫院病理科1、檢驗科2，四川 遂寧 629000)

目的介紹本科室探索的一種骨髓穿刺組織的快速脫鈣處理方法。方法通過查閱參考文獻、細致研究病理科常用試劑理化特性結合骨髓穿刺組織特點，試驗出一種骨髓穿刺組織快速脫鈣方法。結果采用本方法處理骨髓穿刺組織簡便快捷，僅需2～4 h；骨髓組織處理質量滿意，各造血系統細胞染色鮮明、透亮，示細胞核與細胞質對比度清晰；骨小梁脫鈣完全，結構清楚，呈鮮艷紅色，免疫組織化學染色高質量陽性顯色，低背景著色，無非特異性顯色的特點。結論該方法是較為簡便實用的骨髓組織快速處理方法，提高工作效率，值得在病理科工作中推廣采用。

骨髓；穿刺組織；快速處理；新方法

病理科診斷工作中，骨髓穿刺活檢是其中重要一項。對骨髓組織的脫鈣處理是病理技術的核心環節，骨髓組織的高效快速脫鈣處理是病理診斷的先決條件。本文在查閱文獻基礎上，結合本科室的長期探索，現介紹一種骨髓組織的快速脫鈣方法。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 中性甲醛溶液(濃度37.5%～40.0%)，冰乙酸溶液(濃度99.7%)，氨水(濃度25.0%～28.0%)，濃鹽酸(濃度37.5%)，無水乙醇(濃度99.7%)，以上試劑均為分析純級(AR級)，購自成都科隆化工試劑廠(成都，科隆)；去離子水由科室自制；組織脫水機：LEICAASP300S，組織包埋機：LEICA EG1150H，全自動HE染色機：LEICA AUTO STAINER XL均購自德國徠卡公司(德國，徠卡)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓處理液配置 本方法中對骨髓穿刺組織處理由三種處理液組成：1)骨髓固定及預脫鈣液(AAF液)；2)骨髓快速脫鈣液(15%鹽酸)；3)骨髓脫鈣后平衡液(1%氨水)。具體配置為：1)AAF液100 mL (中性甲醛10 mL，無水乙醇80 mL，冰乙酸5 mL，去離子水5 mL)；2)15%鹽酸100 mL(濃鹽酸15 mL，去離子水85 mL)；3)1%氨水100 mL(氨水1 mL，去離子水99 mL)。以上處理液配置完成后密封保存置室溫過夜后即可使用。

1.2.2 骨髓處理流程 臨床骨髓穿刺組織標準大小為長約2 cm，直徑0.4 cm，使用柔軟透水性的顯微鏡擦鏡紙包裹骨髓穿刺組織后，進行以下處理：(1)骨髓固定及預脫鈣：置AAF液30 min～2 h，根據骨髓組織硬度調整處理時間，標準大小的骨髓組織處理時間為1.5 h，散碎或較小骨髓組織處理時間為30 min～1 h，骨組織成分較多的骨髓組織處理時間可延長至2 h，流水沖洗1min，去除殘留的AAF液后，轉入無水乙醇1 h，該步驟利用無水乙醇的中性脫水特點將AAF液處理后的骨髓組織進一步脫水固定并且盡量保護骨髓中的造血系統細胞。(2)骨髓快速脫鈣：將經過固定和預脫鈣處理后的骨髓組織轉入15%鹽酸10～40 min，期間需每10 min使用探針刺入骨髓組織，可輕松刺入即為脫鈣完全，標準大小的骨髓組織處理時間為30 min，散碎或較小組織時間多為10～15 min，并且需持續觀察，以免過度脫鈣而導致組織溶解為細胞液，骨組織成都較多骨髓組織處理時間可延長至40 min，流水沖洗1 min，去除殘留的鹽酸溶液，該步驟將骨髓穿刺組織快速脫鈣完成。(3)骨髓脫鈣后平衡：將快速脫鈣后的骨髓組織轉入1%氨水10 min，1%氨水為弱堿性可持續提供OH-離子中和殘留的鹽酸H+離子，流水沖洗1 min。至此，骨髓組織處理完成，再經脫水、浸蠟、包埋、制片、HE染色，或進行免疫組織化學染色。

2 結 果

本科室采用本方法處理骨髓組織440例，處理期間觀察骨髓組織變為較透亮，探針可輕松刺入骨髓組織為脫鈣完成。在我科多數標本可在3 h完成脫鈣處理，再經脫水、浸蠟、包埋、制片、HE染色后，骨髓組織中各造血系統細胞染色鮮明、透亮，骨小梁脫鈣完全，結構清楚，呈鮮艷紅色(圖1)，細胞核與細胞質對比度清晰(圖2)，免疫組織化學染色MPO(圖3)，免疫組織化學染色CD79α(圖4)。

圖1 骨髓組織中各造血系統(HE 10×4)

圖2 骨髓組織中造血細胞核與細胞質對比(HE 10×20)

圖3 骨髓組織免疫組化染（抗體標記：MPO；HE 10×10）

圖4 骨髓組織免疫組化染(抗體標記：CD79α；HE 10×20)

3 討 論

骨髓組織中骨小梁的無機鹽主要為磷酸鈣及碳酸鈣，質地堅硬，直接制片非常困難，且切片質量較差。

目前，病理科骨髓組織制片有兩種方法：其一是塑料包埋直接切片法[1]，該方法采用合成塑料直接包埋骨髓后進行切片、HE染色，雖省去脫鈣步驟，但存在以下缺點：包埋劑使用塑料為商品化產品價格較昂貴，含有毒性且制片時間較長(5～7 d)[2-3]。包埋劑配制比例、塑料聚合時間，切片使用刀口、切片機性能，病理技術人員的技術要求，撈片、烘干等技術環節均有較高要求[4]。由于以上原因，本科室采用傳統的酸溶脫鈣法[5]進行骨髓組織處理。

本方法首先采用AAF液對骨髓組織處理，AAF液中甲醛為組織固定劑，具有較強的穿透力，通過網格狀交聯蛋白質分子而達到固定組織的作用，對組織收縮作用小且均勻，并能減少酸對組織的侵蝕[6]，可先將骨髓組織中的造血細胞，纖維結締成分進行有效固定，保護組織及細胞形態。乙醇為良好的脫水劑，可起到脫水效果并兼具固定作用，骨髓組織中含有豐富的脂肪成分，乙醇可溶解該成分便于制片[7]。冰乙酸為弱酸，能夠溫和地持續提供H+，可以溶解骨髓中的鈣質，在骨髓組織固定的過程中該成分起到脫鈣效果，從而減少脫鈣所用時間[7]。

本方法對骨髓組織脫鈣主要步驟為采用鹽酸進行處理，鹽酸與硫酸和硝酸同為無機強酸，均能夠提供強H+來溶解骨小梁中鈣鹽。但后兩者缺陷[8]為：硫酸的酸根可與鈣離子形成難溶的硫酸鈣沉淀而使骨髓重新變硬。硝酸在溶解鈣鹽的同時可產生含氮化合物使組織蛋白質變性形成黃蛋白反應，且甲醛可被硝酸氧化變性而失去固定效果，同時降低硝酸濃度[9]。本方法中采用鹽酸濃度為15%(體積分數：37.5%濃鹽酸15份+去離子水85份)，有文獻報道無機酸對骨髓組織細胞及免疫組織化學的影響關鍵在于酸與骨髓的作用時間，即時間越長，組織損傷越大[10]。本科室在參考文獻經驗報道[11-12]及不斷試驗的基礎上，最終確定為15%鹽酸(體積分數)作用2 h內效果最佳。

本方法最后采用1%氨水(體積分數)來浸泡脫鈣后骨髓組織，目的在于利用氨水的弱堿性可溫和地持續提供OH-來中和殘存的H+，且氨水極易洗脫而無殘留。有文獻報道，采用混合酸脫鈣及EDTA雙重脫鈣固定后進行免疫組織化學染色[13]。該方法中采用兩組脫鈣液：脫鈣液A(甲酸、甲醛、冰乙酸、濃鹽酸、氧化鋁、氯化鈉)作用3 h，沖洗1 h，脫鈣液B(EDTA，鹽酸)作用2 h來完成脫鈣程序，可獲得較好的免疫組化染色效果。本文方法與上述方法相比具有以下優勢：(1)脫鈣液試劑種類少，本文方法脫鈣液僅兩種，以冰乙酸為預脫鈣，以15%鹽酸為主進行快速脫鈣。上述方法中脫鈣液配制試劑種類達8種，且配置方法繁瑣；(2)脫鈣程序簡便，時間短，本文方法脫鈣步驟僅為10～40 min即可完成，采用1%氨水處理脫鈣后骨髓組織，采用弱堿OH-離子迅速去除殘留H+。上述方法兩組脫鈣液需作用5 h，中間需沖洗1 h，總時間達6 h，時間多于本文方法。本文方法處理后的骨髓組織進行免疫組織化學染色能夠保證高質量陽性顯色，低背景著色，無非特異性顯色的特點。

本方法將組織固定和脫鈣兩個步驟有效的結合，所用時間為2～4 h，相較于劉增輝等[14]報道方法具有步驟簡便，方法快速，所用試劑種類少，配制方便等優點。

綜上所述，該方法是較為簡便實用的骨髓組織快速處理方法，在病理科技術工作中需要細致用心地做好每個環節，認真鉆研，不斷探索嘗試才能不斷提高效率，制作更高質量的病理切片。

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R446.8

B

1003—6350（2017）01—0157—03

2016-08-01)

四川省遂寧市市級科研項目（編號：2015s02）；四川省遂寧市中心醫院科研課題（編號：2015y02）

楊娜。E-mail：liulubb@126.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.053