非酶糖基化終末產物介導的ERK1/2信號轉導通路在大鼠睪丸間質細胞睪酮分泌中的作用

戚亞偉，胡傳銀，陳紹紅，趙云濤，劉鈾

(1.廣東醫科大學附屬醫院整形外科研究所，廣東 湛江 524001；2.廣東醫科大學細胞生物學教研室，廣東 湛江 524023；3.廣東海洋大學現代生化中心，廣東 湛江 524088)

非酶糖基化終末產物介導的ERK1/2信號轉導通路在大鼠睪丸間質細胞睪酮分泌中的作用

戚亞偉1，胡傳銀2，陳紹紅3，趙云濤3，劉鈾3

(1.廣東醫科大學附屬醫院整形外科研究所，廣東 湛江 524001；2.廣東醫科大學細胞生物學教研室，廣東 湛江 524023；3.廣東海洋大學現代生化中心，廣東 湛江 524088)

目的探討非酶糖基化終末產物(AGEs)對大鼠睪丸間質細胞睪酮分泌的影響及其潛在機制。方法首先，原代培養大鼠睪丸間質細胞，采用3β-HSD免疫細胞化學方法對間質細胞進行鑒定；其次，MTT法測定不同濃度的AGEs(25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)及200 μg/mL BSA作用Leydig細胞后的細胞活力；最后，用不同濃度的AGEs及200 μg/mL BSA預處理Leydig細胞12 h，之后更換含相應濃度AGEs或BSA的培養基并加入終濃度為4 U/mL的hCG，其中對照組不含AGEs和BSA，ELISA法和Western blot分別檢測睪酮分泌量和p-ERK1/2的表達量。結果MTT法表明AGEs(≤200 μg/mL)對Leydig細胞的活力在本實驗所研究的時間內沒有影響；ELISA法和Western blot結果顯示，不同濃度AGEs處理后，hCG誘導的Leydig細胞睪酮合成量和ERK1/2蛋白的磷酸化都呈現濃度依賴性下降，與對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)。結論AGEs通過抑制ERK1/2的磷酸化降低大鼠Leydig cells睪酮的分泌。

非酶糖基化終產物；睪丸間質細胞細胞；細胞外調節蛋白激酶；睪酮

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由多種病因引起的糖、蛋白質和脂肪代謝紊亂的一種疾病。糖尿病(DM)損害男性的生殖健康，約有90%的糖尿病患者伴隨有性功能障礙，其中包括了性欲降低、陽痿及不育等，研究人員已經從結構和生理功能上證明了糖尿病可以導致男性生殖系統紊亂[1-4]。近年來，研究發現DM時持續的高糖環境造成的非酶糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)的過量形成是引發糖尿病及其慢性并發癥的重要原因之一[5-6]。糖尿病可誘發睪酮分泌的下降[7]，但AGEs對睪丸間質(Leydig)細胞的影響尚不清楚。本研究將試圖探索AGEs對睪丸Leydig細胞分泌睪酮的影響及機制，以期揭示糖尿病引發生殖系統功能紊亂的部分機理。

1材料與方法

1.1 實驗動物 健康8周齡SD雄性大鼠，由廣東省醫學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 Ⅰ型膠原酶、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、多聚甲醛、脫氫表雄酮(DHEA)及牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma公司，Percoll(GE公司)，DMEM/F12、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，睪酮測定試劑盒(美國Cayman公司)，抗Phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2)抗體(Cell Signal公司)。

1.3 AGEs的制備[9]將終濃度為5 mg/mL的BSA與終濃度為50 mol/L的葡萄糖溶于10 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中(pH 7.4)，置于37℃溫箱內避光孵育。并向溶液中加入PMSF(1.5 mol/L)和EDTA (0.5 mol/L)的蛋白酶抑制劑和1%的雙抗，7周后，通過透析去除未結合的葡萄糖。其對照物BSA的制備和上述步驟相同，只是其中不加葡萄糖。根據AGEs自身特有的熒光特性，在370 nm激發波長，440 nm發射波長下，于熒光分光光度計(F-7000)上測定其熒光值(狹縫寬度5 nm)分別測定AGEs和BSA的熒光值，結果發現，AGEs的熒光值與BSA相比大幅度升高，約增加到了53倍。同時根據BCA蛋白定量試劑盒說明書說明測定透析后AGEs和BSA的蛋白濃度AGEs的濃度為20.47 μg/mL，BSA的濃度為18.19 μg/mL。

1.4 Leydig細胞的分離、純化和鑒定 Leydig細胞的原代培養在參考Klinefelter等[9]和Chemes等[10]方法的基礎上做了一些改進。具體如下：雄性SD大鼠通過CO2窒息處死，之后迅速的取出睪丸轉移到超凈臺中，保持睪丸實質完整，冰面上無菌剝離被膜及較大血管，使睪丸實質保持完整。無菌PBS液清洗2～3遍，之后經鑷子將睪丸實質撥散，將睪丸置于0.05%的Ⅰ型膠原酶(PBS配置)中，34℃恒溫180 g消化30 min，使睪丸實質散開，但生精小管未斷裂。用等體積的完全培養基(10%FBS的DMEM/F12)終止消化，經消化后所得到的懸浮液體經200目的篩網過濾，之后將濾液轉移到離心管中，1 200 r/min離心5 min。之后用細胞培養液懸浮所得到的沉淀，所得到的細胞懸液加于4個不連續密度的Percoll梯度液上(從上到下：21%、26%、37%、60%)，離心(3 000 r/min、4℃)30 min，可看到有4條明顯的細胞帶，取37%與60%梯度之間(即第3條細胞帶)的細胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清，重懸細胞，調節細胞濃度為1×106/mL，置于34℃、5%CO2培養箱中。細胞活力經臺盼藍鑒定。由于Leydig特異的含有3β-HSD，故采用3β-HSD染色法鑒定Leydig細胞。貼壁24 h的Leydig細胞，棄去培養液，PBS清洗3遍，每次5 min，之后室溫下干燥1 h左右，接著加入新鮮配制的3β-HSD染色劑(染液由A和B組成。A液：1 mg NBT溶于0.6 mL含有1 mg/mL DHEA的DMSO中；B液：10 mg L DHE用溫暖的PBS溶解)染色90 min，之后經超純水沖洗，4%的多聚甲醛固定，顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 MTT法測定Leydig細胞活力 將分離純化的原代Leydig細胞接種于96孔板中，隨機分為對照組、AGEs組和BSA組，其中AGEs組設置四個濃度梯度，分別為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL及200 μg/mL，BSA組只一個濃度，為200 μg/mL，每個處理組4個重復，其中AGEs組和BSA組分別加入含相應終濃度AGEs和BSA的DMEM/F12培養基，對照組只用DMEM/F12培養基，培養48 h后，棄去各孔中的培養基，PBS清洗2～3遍，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液(50 mg MTT溶于10 mL的PBS中，0.22 μm濾膜過濾，現用現配)，置于34℃培養箱中4 h，小心棄去溶液以免吸出孔中沉淀，之后每孔加入150 μL的DMSO，搖床上10 min，之后于490 nm處測定OD值。

1.6 AGEs對hCG刺激的大鼠Leydig細胞分泌睪酮的影響 將分離純化的原代Leydig細胞接種于6孔板中，將Leydig細胞隨機分為對照組、hCG組、AGEs組和BSA組。其中AGEs組設置四個濃度梯度，分別為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL及200 μg/mL，BSA組只一個濃度，為200 μg/mL，每個處理4個重復，不同濃度的AGEs組和BSA組分別加入含相應終濃度的AGEs和BSA預處理12 h，對照組換DMEM/F12培養基，AGEs組和BSA組分別更換含相應濃度的AGEs或BSA的DMEM/F12培養基并加入終濃度為4 U/mL的hCG，hCG組換含終濃度為4 U/mL hCG的DMEM/ F12培養基，24 h后取細胞培養液，離心后，將上清液凍存于-80℃，待用于睪酮含量的測定。

1.7 睪酮的測定 按試劑盒說明操作測定睪酮的含量。

1.8 Western blot檢測磷酸化ERK1/2的表達 將原代分離的Leydig細胞接種到細胞培養瓶中，將Leydig細胞隨機分為對照組、hCG組、AGEs組和BSA組。其中AGEs組設置三個濃度梯度，分別為50 μg/mL、100 μg/mL及200 μg/mL，BSA組只一個濃度，為200 μg/mL，每個處理4個重復，不同濃度的AGEs組和BSA組分別加入含相應終濃度的AGEs和BSA預處理Leydig 12 h之后，更換含相應濃度AGEs或BSA的DMEM/F12培養基并加入終濃度為4 U/mL的hCG，hCG組換只含4 U/mL的hCG DMEM/F12，對照組換DMEM/F12，處理48 h后，提取Leydig細胞的總蛋白，Western blot檢測ERK1/2磷酸化的情況。

1.9 統計學方法 應用SPSS17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩組間多重比較采用最小顯著差異法(LSD)檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠Leydig細胞的培養與鑒定 Percoll分離到的大鼠Leydig細胞經臺盼藍染色法顯示，細胞存活率在95%以上。剛接種的Leydig細胞多呈圓形，未鋪展，12 h后細胞形狀呈圓形、多邊形或梭形，隨著時間的延長，胞體開始有細長觸角伸出，24 h后長梭形的細胞大量增殖、所占比例明顯增加，大多數細胞伸展開來，呈現拉絲狀或樹突狀，72 h后可觀察到細胞相互連接呈現典型的拉網狀結構(圖1)。接種24 h后的Leydig細胞經3β-HSD特異性染色，由圖可見，大多數細胞胞質呈現藍黑色，少數的細胞胞質淡染，細胞純度達90%以上(圖2)。

圖1 大鼠Leydig細胞

圖2 大鼠睪丸Leydig細胞3β-HSD染色(標尺為50 μm)

2.2 AGEs對Leydig細胞活力的影響 為了確定AGEs是否對大鼠睪丸Leydig細胞有毒性作用，采用MTT法測定細胞的活力，結果如圖3所示。將對照組Leydig細胞所測得的OD值定義為100%，各濃度AGEs組的OD值與BSA組和對照組相比，差異無統計學意義(P＜0.05)，說明AGEs處理48 h對Leydig細胞的活力沒有影響。

圖3 AGEs對大鼠Leydig細胞活力的影響

2.3 AGEs抑制睪酮的產生 經試劑盒的測定，4 U/mL hCG誘導后的大鼠Leydig細胞培養液中睪酮的合成量大幅度增加，是對照組的2.73倍，差異達到極顯著(P＜0.01)。AGEs處理組中，隨著AGEs濃度的增加，hCG誘導的睪酮合成量開始呈現下降趨勢，其中，與hCG處理組相比，50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的AGEs處理組中睪酮合成量分別降低了26.2%、41.3%、51.4%，差異有顯著統計學意義(P＜0.01，圖4)。

圖4 不同濃度AGEs對hCG誘導的大鼠Leydig細胞睪酮分泌的影響

2.4 AGEs刺激睪丸Leydig細胞后p-ERK1/2蛋白水平的變化 由圖5可以看出，ERK有兩個異構體，分別是ERK1和ERK2，分子質量分別為42 kD、44 kD，對照組和BSA組不影響ERK1/2蛋白的活化，加入hCG后，ERK1/2的磷酸化明顯上調，是對照組的3.29倍，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。AGEs刺激后，隨著AGEs濃度的增加，與hCG組比較，ERK1/2蛋白的磷酸化下調越明顯，與hCG組比較，50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的AGEs與對照組相比以劑量依賴性方式下降了6.32%、28.8%、61.6%，差異有統計學意義(P＜0.01)。

圖5 AGEs對p-ERK1/2蛋白表達的影響

3 討論

AGEs是蛋白質、脂質和核酸等大分子的游離氨基與還原性單糖的醛基反應所生成的穩定的共價化合物。正常機體內的AGEs水平維持在一個較為平衡的狀態，但在糖尿病、衰老等情況下，AGEs的生成會異常的增加，將會打破機體原有的平衡，誘發機體產生一系列的病理和生理的變化。高糖環境下必然會引發體內AGEs的異常會增加，報道的有關數據表明，AGEs水平的高低與糖尿病慢性并發癥發生、發展的程度呈明顯正相關[11-12]，目前普遍認為，在持續高血糖的環境下，機體組織內的多種重要蛋白質發生非酶糖基化終末反應是引發糖尿病及其慢性并發癥的重要原因之一[13-14]。

睪丸的主要功能即是合成睪酮和生成精子，是男性生殖系統的重要器官，Leydig細胞是成年的雄性動物分泌雄激素(睪酮)的主要來源，睪酮產生后，其中一部分進入血液，作用于遠方的靶組織，參與行為的調節和雄性第二性征的維持；另一部分作用于生精上皮，參與精子發生的調節。黎英榮等[15]的研究發現糖尿病大鼠陰莖組織中積累了大量的AGEs，目前，AGEs對睪丸Leydig細胞功能的作用尚不清楚。

細胞外調節蛋白激酶(ERK)由ERK1和ERK2構成，分子量大小為42 kD和44 kD，統稱為ERK1/2，是將信號從細胞表面的受體轉導至核內的關鍵酶，只有ERK1/2磷酸化了才具有活性，磷酸化的ERK1/2通過對一些轉錄因子(如ATF，Jun，EIk-l)活性的調節，引發特定蛋白的表達及活性的改變，最終調控細胞的功能和代謝，影響細胞的形態維持、細胞凋亡、細胞的增殖和分化等特定的生物學反應[16-17]。眾所周知，EKR1/2參與調節細胞的存活，它在介導細胞增殖和細胞凋亡中的角色一直備受爭議，既可以引起細胞的增殖，又可導致細胞的凋亡，具有雙重作用，據報道，激活的EKR1/2可以造成DNA損傷，導致細胞周期阻滯和細胞凋亡[18]。

目前為止，ERK1/2參與類固醇激素的合成已經得到了確定[19-20]，但是其具體角色和詳細機制仍然是模糊不清的。ERK1/2和類固醇激素的合成都要受到cAMP-PKA信號傳導途徑的調控，而且ERK1/2在cAMP的作用下發生活化促進類固醇激素的合成。

本試驗原代培養大鼠Leydig細胞，探討AGEs對Leydig細胞睪酮的分泌的作用，MTT結果表明，不同濃度的AGEs(25～200 μg/mL)對Leydig細胞活性無明顯影響，AGEs顯著抑制睪丸Leydig細胞睪酮的產生，且在25～200 μg/mL的范圍內呈濃度依賴性，緊接著研究AGEs是通過什么途徑來抑制睪酮的合成，實驗結果發現，AGEs以劑量依賴性方式抑制ERK1/2的磷酸化，從而說明AGEs可通過抑制ERK1/2信號通路以影響Leydig細胞睪酮的分泌。在2001年，Dewi等[21]發現在人類的黃體細胞中hCG刺激cAMP濃度升高，以劑量和時間依賴方式使ERK1/2激活，促進類固醇激素的生成。Martinelle等[20]發現，在hCG刺激下的Leydig細胞中，ERK1/2在調節睪酮合成的關鍵蛋白StAR中扮演著十分重要的角色，ERK1/2可以上調StAR蛋白的表達，從而促進膽固醇進入線粒體內，使睪酮的合成增加。2010年時張穩等[22]的研究中得出結論，ERK1/2是通過影響3β-HSD的合成來實現對大鼠睪丸Leydig細胞睪酮合成的調節作用。hCG是通過激活腺苷酸環化酶來促進ATP分解為cAMP，cAMP再通過激活蛋白激酶A(PKA)使ERK1/2磷酸化，磷酸化的ERK1/2通過對睪酮合成關鍵因子的調節作用來介導睪酮的分泌。本研究證明hCG激活了ERK1/2的活化，AGEs抑制了ERK1/2的磷酸化，使睪酮的合成量降低，從而影響到男性生殖。

本文結果發現，AGEs部分通過抑制ERK介導的信號抑制睪丸間質細胞分泌睪酮，這為探討糖尿病引發生殖系統功能紊亂提供了一定理論依據。AGEs引發Leydig分泌睪酮量下降的原因及其他相關機制是十分復雜的，還有待于繼續深入研究。

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Role of ERK1/2 signaling pathway mediated by advanced glycation end products in testosterone secretion of rat Leydig cells.

QI Ya-wei1,HU Chuan-yin2,CHEN Shao-hong3,ZHAO Yun-tao3,LIU You3.1.Institute of Plastic Surgery,Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA;2.Department of Cell Biology,Guangdong Medical University,Zhanjiang 524023,Guangdong,CHINA;3.Modern Biochemistry Center, Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of advanced glycation end products(AGEs)on testosterone production of rat Leydig cells and its underlying mechanism.MethodsFirst,the primary Leydig cells were isolated,purified and cultured in vitro.The stromal cells were identified by 3β-HSD immunocytochemistry.Second,the effects of various concentrations of AGEs(25 μg/mL,50 μg/mL,100 μg/mL and 200 μg/mL)and BSA(200 μg/mL)on Leydig cell viability were evaluated by MTT.Finally,Leydig cells were pre-incubated with various concentrations of AGEs and 200 μg/mL BSA for 12 h.Then,the culture medium was replaced with fresh medium containing human chorionic gonadotropin (hCG,4 U/mL)with or without the same concentrations AGEs and BSA.The control group did not contain AGEs and BSA.The secretion of testosterone induced by human chorionic gonadotropin(hCG)was determined by ELISA.The protein expression levels of ERK1/2 phosphorylationwere were measured by western blot.ResultsMTT data indicated that the viability of the Leydig cells treated with AGEs(concentrations≤200 μg/mL)was not significantly altered.ELISA and western blot showed that AGEs could remarkably suppress testosterone production and decrease the phosphorylation levels of p-ERK1/2 induced by hCG in a concentration-dependent manner in rat Leydig cells compared with the control group (P＜0.01).ConclusionAGEs decrease testosterone secretion in rat Leydig cells by inhibiting ERK1/2 phosphorylation.

Advanced glycation end products(AGEs);Leydig cell;Extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2);Testosterone

R-332

A

1003—6350（2017）01—0001—05

2016-07-11)

趙云濤。E-mail：yuntaozhao@163.com；劉鈾。E-mail：liuy6254282@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.001