MicroRNAs調控機制及檢測方法的研究進展

梁潔玲,王洋洋,司艷輝,李海珠,陳立強

(肇慶市第一人民醫院,廣東 肇慶 526060)

MicroRNAs(miRNA)是由18-22nt組成的非編碼RNA,其在基因表達過程中發揮調節作用。隨著序列檢測技術的提高,對miRNA的研究亦進一步深入,而新穎的miRNA合成技術開展也加深了我們對miRNA的認識[1]。許多研究機構已經報道miRNA在癌癥、糖尿病、心臟病和自身免疫性疾病中均發揮調節作用,而且miRNA在多種體液中存在,包括血漿、血清、尿液、精液和唾液等；對體液miRNA進行檢測可對某些疾病的診斷和藥物治療提供更科學的依據,故miRNA可作為某些疾病的診斷標記物并推廣應用[2]。此文針對miRNA調節機制及近期檢測方法進行綜述,以了解miRNA的檢測方法的最新進展。

1 miRNA簡介

真核細胞基因表達的傳統中心法則是DNA轉錄mRNA,再由mRNA翻譯為蛋白質。自從miRNA被發現,讓我們對RNA的生成和調控機制有了新的認識。miRNA是微小(21-22nt)的RNA,其功能主要是調節基因表達和蛋白質的生物合成[3]。miRNA可通過識別mRNA的特定序列,抑制多種類型的mRNA轉錄和影響蛋白質的合成。通過對miRNA的功能研究發現,miRNA的調控錯誤會影響多種基因表達,最終導致疾病的發生。miRNA主要來自其靶基因的基因序列之間或基因內區,這類miRNA與靶基因共同轉錄,再識別細胞內環境的狀況對靶基因進行調控,達到細胞內環境平衡[4]。某些miRNA前體是由蛋白編碼基因或非蛋白編碼基因序列內區轉錄生成,或者來源于非蛋白編碼基因RNA的外顯子序列,因此該類miRNA的表達主要作用于其靶基因。另外有部分miRNA主要作用于啟動子序列的多順反子區域,在miRNA修飾成熟過程中保持多種類型的莖環結構[5]。

2 miRNA生成與調控機制

miRNA的生成需要多種蛋白酶,pri-miRNA的剪切須RNAse III Drosha和DGCR8(一種雙鏈RNA結合蛋白),這種蛋白復合物是由大約70nt核苷酸組成的莖環結構的pre-miRNA,pre-miRNA的3’和5’磷酸末端向外伸展,形成獨特的莖環結構[6]；這時pre-miRNA通過Exportin-5(一種Ran-GTP依賴蛋白)轉運到細胞質中。pre-miRNA轉運到細胞質后通過Dicer(RNAse III蛋白酶)剪切,同時與轉運激活反應性RNA結合蛋白(transactivation Response RNA-Binding Protein,TRBP)形成聯合體[7]。此時pre-miRNA的莖環結構會解開并且3’末端會伸出約22nt的RNA雙鏈結構,Dicer將此RNA轉運至Ago(Argonaute)蛋白并相互結合,構成RNA誘導沉默復合物(RNA-Induced Silencing Complex,RISC)；此時該RISC是前體RISC,要形成成熟的RISC還需進行該RNA雙鏈的分離,該過程稱為RNA的鏈分選過程。RNA的鏈分選過程主要由熱力學因素決定,主要取決于RNA雙鏈的前面4個核苷酸分子。因此,首先末端分離的RNA單鏈作為向導鏈生成miRNA復合物,而隨從鏈會被分解處理。細胞質中成熟的RISC復合物可尋找與miRNA序列相匹配的mRNA,miRNA與mRNA根據Watson-Crick法則進行配對結合,結合區域是mRNA的3’未翻譯區域(untranslated region,UTR ) 與miRNA的“種子序列”(即miRNA第2-8的核苷酸序列)[8]。miRNA不一定都是以DNA序列作為模板,有6%的人體miRNA以RNA作為模板進行編輯。此外,單獨的pre-miRNA可以生成多種成熟的miRNA,每種miRNA序列的長度和核苷酸順序均不相同,該類型的miRNA稱為isomiRNA。這種miRNA的編輯可改變“種子序列”的結構,從而改變miRNA與靶向mRNA的識別,此機制講改變miRNA對靶基因的選擇。細胞內不同類型的isomiRs表達會影響不同蛋白的表達,miRNA的類型和數量均能影響該細胞的生理功能,若miRNA的生成以及表達發生異常,會直接導致細胞和組織的內部功能紊亂[9]。沉默mRNA可使mRNA降解或抑制其表達,miRNA與mRNA匹配結合后,通過Ago酶作用對mRNA進行剪切,而如果miRNA與mRNA不是完全匹配,則會抑制mRNA的表達,對蛋白質翻譯的過程產生抑制機制[10]。

3 miRNA檢測

3.1 實時定量PCR測定miRNA

由于miRNA序列較短,難以利用其有效的特異性引物和探針對其進行實時定量PCR檢測,而有些學者利用較長的pre-miRNA作為把序列進行檢測,但pre-miRNA的檢測不能真實反映miRNA的表達水平[11]。現在的解決方法是設計一種莖環狀的PCR引物對miRNA進行逆轉錄,然后對cDNA再進行實時定量PCR檢測。RT-PCR引物的設計有2種類型,一是有Oligod(T)特異的RT引物,該引物包含與miRNA互補序列加上約20個左右的Oligod(T)結構；二是莖環狀結構的RT-PCR引物,由可以形成特異性環莖狀的特異序列的6-8個與miRNA3’端反向互補堿基構成,一個莖環狀結構的RT引物與一條miRNA序列特異引物相互對應。兩種引物各自有其優點,Oligod(T)特異的RT引物設計簡單而且檢測通量高,而莖環狀結構的RT-PCR引物的靈敏度和特異性比前者高[12]。

3.2 生物芯片測定miRNA

生物芯片檢測miRNA的技術路線主要包括了樣品RNA的準備、生物芯片的預處理、芯片的掃描及數據讀取和最后的數據分析。生物芯片經雜交后,數據通過熒光檢測設備檢測熒光的強度,芯片上的每一個雜交點都是單一的miRNA雜交信號,通過設備精細讀取芯片的信息,可以獲取這些雜交信號的相對表達強弱[13]。隨后將芯片探針類型與數據庫探針類型進行同步處理,讀取雜交的信號進行預處理,各個探針的表達水平形成數據再與特定基因的表達進行背景校正,多種樣品進行比較和數據整合,最終得到miRNA的相對表達量。通過不同的實驗設計與多樣的統計手段,可做反映miRNA或者甲基化的區域的相關研究。隨著miRNA芯片技術的發展,可進行miRNA靶基因的預測,或利用分析軟件對相關基因進行功能分析；根據數據庫信息整合,發現新的生物信號和代謝通路。因此,大數據庫的整合利用可完成miRNA-miRNA表達相關性分析,miRNA-靶mRNA表達相關性分析和對miRNA功能推導,從而得到異常miRNA參與的生物學過程[14]。

4 結語

綜上所述,miRNA對轉錄后調控產生重要的調控作用,miRNA與mRNA結合而抑制其翻譯過程。研究發現大部分病理過程均出現miRNA表達異常,故miRNA可作為某些疾病的標志物進行檢測,更深入的研究miRNA的功能和特征、檢測方法的更新為其作為診斷手段提供更合理的素材。因此,miRNA可作為疾病診斷和預測的新的標志物,而診斷標準和診斷數據的整合,標本的處理和保存,技術流程的規范對miRNA成為診斷標志物至關重要。

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