卵巢子宮內(nèi)膜異癥不孕患者異位內(nèi)膜組織中FMO3、DMBT1的表達(dá)變化及其意義

王秋陽(yáng)，林偉，王福玲，王雅琦，許偉偉

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，山東青島266071；2青島大學(xué)附屬醫(yī)院)

卵巢子宮內(nèi)膜異癥不孕患者異位內(nèi)膜組織中FMO3、DMBT1的表達(dá)變化及其意義

王秋陽(yáng)1，林偉2，王福玲2，王雅琦1，許偉偉1

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，山東青島266071；2青島大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 觀察卵巢子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)不孕患者異位內(nèi)膜組織中的含黃素單氧化酶3(FMO3，在輸卵管上皮組織高表達(dá))、腦惡性腫瘤缺失基因(DMBT1，在子宮內(nèi)膜組織高表達(dá))mRNA及蛋白，并探討其意義。方法 將卵巢EMs不孕患者的異位內(nèi)膜組織40例份作為觀察組，選取卵巢EMs已育患者的異位內(nèi)膜組織50例份作為對(duì)照組，以正常卵巢組織35例份作為正常組。采用real-time PCR法檢測(cè)三組FMO3、DMBT1 mRNA，采用Western blotting法檢測(cè)FMO3、DMBT1蛋白。結(jié)果 觀察組FMO3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和正常組(P均<0.05)；觀察組、對(duì)照組DMBT1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量高于正常組(P均<0.05)。結(jié)論 卵巢EMs不孕患者異位內(nèi)膜組織中FMO3呈高表達(dá)，異位內(nèi)膜組織來(lái)源可能為輸卵管；輸卵管組織來(lái)源的異位內(nèi)膜組織可能與卵巢EMs患者不孕有關(guān)。

子宮內(nèi)膜異位癥；卵巢子宮內(nèi)膜異位癥；不孕癥；異位子宮內(nèi)膜；含黃素單氧化酶3；腦惡性腫瘤缺失基因

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮體以外部位的一類(lèi)疾病[1，2]。EMs可引起痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等癥狀，且與不孕關(guān)系密切[3～5]。有關(guān)EMs發(fā)病機(jī)制存在多種學(xué)說(shuō)，具體發(fā)病機(jī)制尚未明確。研究[6]表明，EMs病灶組織細(xì)胞部分起源于子宮內(nèi)膜細(xì)胞，部分可能源于輸卵管上皮細(xì)胞。輸卵管上皮細(xì)胞可能是卵巢EMs潛在的組織細(xì)胞來(lái)源。關(guān)于不同來(lái)源的卵巢EMs病灶對(duì)患者生育能力的影響是否存在差異尚未見(jiàn)報(bào)道。為研究不同來(lái)源的卵巢EMs病灶對(duì)生育的影響，我們選擇在輸卵管上皮組織中高度表達(dá)、在子宮內(nèi)膜組織中低表達(dá)的含黃素單氧化酶3(FMO3)作為輸卵管來(lái)源標(biāo)志物，選擇在子宮內(nèi)膜組織中高表達(dá)、在輸卵管上皮組織中低表達(dá)的腦惡性腫瘤缺失基因(DMBT1)作為子宮內(nèi)膜來(lái)源標(biāo)志物[6]，檢測(cè)卵巢EMs不孕患者異位內(nèi)膜組織中的FMO3、DMBT1 mRNA和蛋白，以此觀察卵巢EMs不孕患者異位內(nèi)膜組織的來(lái)源，并分析其與患者不孕的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對(duì)象選自2014年5月～2015年5月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)治療的女性住院患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有正常月經(jīng)周期及排卵，基礎(chǔ)性激素檢查正常；②手術(shù)治療前3個(gè)月無(wú)激素類(lèi)藥物治療史；③排除子宮腺肌癥、子宮先天發(fā)育異常、急性盆腔炎、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜增生癥患者及子宮內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)粘連等子宮內(nèi)病變患者及自身免疫性疾病患者。納入行卵巢巧克力囊腫剝除術(shù)的卵巢EMs合并不孕患者50例，年齡25～35(29.4±2.7)歲，不孕年限1～10年，患者同時(shí)行宮腔鏡與腹腔鏡手術(shù)，輸卵管通暢，術(shù)中留取異位內(nèi)膜40例份作為觀察組；行卵巢巧克力囊腫剝除術(shù)的卵巢EMs已育患者50例，年齡26～45(30.6±5.4)歲，術(shù)中留取異位內(nèi)膜50例份作為對(duì)照組；因一側(cè)卵巢病變而行雙側(cè)卵巢切除的患者35例，年齡28～45(32.0±3.2)歲，術(shù)中留取正常卵巢組織50例份作為正常組。三組患者年齡、BMI等資料具有可比性。本研究方案經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 各組FMO3、DMBT1 mRNA檢測(cè) 采用real-time PCR法。參照TRIzol說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于PCR擴(kuò)增。基因引物由上海生工生物公司合成。FMO3基因上游引物序列為5′-AATTCGGGCTGTGATATTGC-3′，下游引物序列為5′-TTGAGGAAGGTTCCAAATCG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度20 bp；DMBT1上游引物序列為5′-TGCTCTGTCTGCCAAATCAC-3′，下游引物序列為5′-GTCATTGTCTGCCTGCTTGA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度20 bp；內(nèi)參GAPDH基因上游引物序列為5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物序列為5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度24 bp。PCR反應(yīng)在FTC2000型熒光定量PCR儀上進(jìn)行，使用2×Sybr Green qPCR Mix試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR反應(yīng)，每個(gè)標(biāo)本設(shè)3個(gè)副孔。以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量[7]。

1.3 各組FMO3、DMBT1蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取出各組組織，加細(xì)胞裂解液冰上勻漿提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。每孔加入50 μg總蛋白，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。封閉后加入相應(yīng)一抗FMO3、DMBT1、GAPDH，4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后加入二抗，孵育并洗膜，ECL顯色液顯色。方正掃描儀掃描條帶，Quantity One軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，以FMO3、DMBT1與GAPDH條帶的相對(duì)吸光度值表示FMO3、DMBT1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組FMO3、DMBT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 觀察組FMO3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和正常組(P均<0.05)；觀察組、對(duì)照組DMBT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于正常組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組FMO3、DMBT1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與正常組相比，*P<0.05；與對(duì)照組相比，△P<0.05。

2.2 各組FMO3、DMBT1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 觀察組FMO3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和正常組(P均<0.05)；觀察組、對(duì)照組DMBT1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于正常組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表1。

3 討論

過(guò)去對(duì)于EMs的研究多基于EMs與在位內(nèi)膜的關(guān)系，從“血逆流學(xué)說(shuō)”到“在位內(nèi)膜決定論”都指出在位內(nèi)膜是EMs發(fā)病的源頭[8]。近年來(lái)，學(xué)者們對(duì)卵巢EMs的組織來(lái)源有了新的發(fā)現(xiàn)。卵巢EMs的異位內(nèi)膜被證實(shí)有一部分來(lái)源于輸卵管[9]。有學(xué)者[10]發(fā)現(xiàn)初始內(nèi)膜異位病灶從輸卵管樣上皮到內(nèi)膜樣上皮移行，或腺體一半呈輸卵管黏膜上皮樣、另一半呈宮體內(nèi)膜上皮樣；隨后又發(fā)現(xiàn)大部分卵巢低級(jí)別漿液性癌也起源于輸卵管黏膜上皮而非卵巢表面生發(fā)上皮，故推測(cè)輸卵管黏膜上皮參與了卵巢EMs的形成，并最終在細(xì)胞和分子水平得到證實(shí)。近年研究[6]表明，約60%的卵巢EMs病灶組織有可能起源于輸卵管上皮細(xì)胞。輸卵管上皮細(xì)胞是卵巢EMs潛在的組織細(xì)胞來(lái)源。

現(xiàn)已證實(shí)，EMs與不孕關(guān)系密切[11，12]。關(guān)于卵巢EMs相關(guān)性不孕與卵巢異位組織來(lái)源的關(guān)系目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究分別選擇FMO3和DMBT1作為輸卵管上皮組織和子宮內(nèi)膜組織的標(biāo)志物。FMO3是一種重要的肝微粒體酶，參與體內(nèi)大量藥物、外源性物質(zhì)和某些化學(xué)物質(zhì)的氧化代謝。DMBT1屬于SRCR超家族，在許多惡性腫瘤組織中常表達(dá)缺失或下調(diào)[13,14]，被認(rèn)為是候選的抑癌基因。本研究結(jié)果顯示，DMBT1在卵巢EMs患者的異位病灶組織中均呈高表達(dá)，F(xiàn)MO3僅在卵巢EMs不孕患者的異位病灶組織中高表達(dá)，提示DMBT1可能在卵巢EMs發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，但與卵巢EMs相關(guān)性不孕無(wú)關(guān)，而FMO3可能與卵巢EMs相關(guān)性不孕有關(guān)。我們推測(cè)，子宮內(nèi)膜為絕大部分卵巢EMs病灶組織的來(lái)源，但子宮內(nèi)膜來(lái)源的卵巢EMs可能并不增加不孕發(fā)生率；而輸卵管組織來(lái)源的卵巢EMs患者不孕發(fā)生率可能增高，輸卵管組織可能與卵巢EMs相關(guān)性不孕存在一定關(guān)聯(lián)，具體機(jī)制尚不明確。

輸卵管組織來(lái)源的卵巢EMs導(dǎo)致不孕與以下因素有關(guān)：①異位的輸卵管組織可能引起盆腔解剖結(jié)構(gòu)改變，引起不孕；②異位的輸卵管組織可能引起卵泡液微環(huán)境改變，后者影響卵母細(xì)胞質(zhì)量及后續(xù)的受精和胚胎發(fā)育[15]；③T、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的免疫功能變化可能與輸卵管組織的生長(zhǎng)與種植有關(guān)，輸卵管來(lái)源的異位病灶組織有可能引起免疫細(xì)胞異常活化及腹腔微環(huán)境改變；④子宮內(nèi)膜容受性降低等[16]。輸卵管來(lái)源的卵巢異位內(nèi)膜組織有可能由生殖干細(xì)胞分化而來(lái)，這些細(xì)胞中HOX基因可能表達(dá)缺失，而HOX參與調(diào)控苗勒管向生殖器官發(fā)育，對(duì)維持子宮內(nèi)膜容受性也有重要作用[16]。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)卵巢EMs患者的異位內(nèi)膜組織來(lái)源為子宮內(nèi)膜，而卵巢EMs不孕患者異位內(nèi)膜組織來(lái)源為輸卵管，輸卵管組織可能在卵巢EMs不孕發(fā)生中發(fā)揮一定作用。在以后的研究中，我們有必要從其他角度或應(yīng)用其他方法進(jìn)一步對(duì)上述結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證。

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王福玲(E-mail: wang.fl2007@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.017

R711.71；R711.6

B

1002-266X(2017)03-0056-03

2016-09-21)