骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞尾靜脈注射治療大鼠肝損傷的效果及機(jī)制

王志紅，林蕓，陳為民，魏天南，林玲，蘇婉婷

(福建省立醫(yī)院，福州350001)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞尾靜脈注射治療大鼠肝損傷的效果及機(jī)制

王志紅，林蕓，陳為民，魏天南，林玲，蘇婉婷

(福建省立醫(yī)院，福州350001)

目的 觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞尾靜脈注射治療大鼠肝損傷的效果，并探討其機(jī)制。方法 將30只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和治療組，每組10只。模型組和治療組大鼠用連續(xù)4個(gè)月皮下注射D-半乳糖的方法成功制備大鼠肝損傷模型。治療組大鼠造模成功后尾靜脈注射3×106個(gè)用綠色熒光蛋白標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞，對(duì)照組注射同等劑量的生理鹽水。3 d后檢測(cè)各組大鼠血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。處死各組大鼠，取肝組織制備冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察間充質(zhì)干細(xì)胞分布，行HE染色觀察肝組織病理結(jié)構(gòu)；取肝組織制成勻漿，用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)，用硫代巴比妥酸法檢測(cè)丙二醛(MDA)，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)肝組織中的p53、p21 mRNA。結(jié)果 治療組大鼠注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后3 d，熒光顯微鏡下可見(jiàn)帶綠色熒光的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞散在于肝臟內(nèi)。光鏡下觀察，對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠肝組織水腫，細(xì)胞邊緣不完整，肝索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)不清；與模型組比較，治療組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，病理?yè)p傷減輕。與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織中SOD水平降低，MDA水平升高，p53、p21 mRNA表達(dá)上調(diào)，血清ALT、AST水平升高(P均<0.05)。與模型組相比，治療組大鼠肝組織中SOD水平升高，MDA水平降低，p53、p21 mRNA表達(dá)下調(diào)，血清ALT、AST水平降低(P均<0.05)。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜注能起到治療D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠肝損傷的效果，其機(jī)制可能與下調(diào)大鼠肝組織中p53、p21 mRNA表達(dá)及減輕肝組織氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；肝損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛；p53基因；p21基因；氧化應(yīng)激反應(yīng)

肝臟是體內(nèi)最大的代謝器官，具有代謝、免疫防御等功能，外源化學(xué)物及人體代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)都在肝臟內(nèi)貯留[1,2]。伴隨人體衰老，肝臟質(zhì)量逐漸下降，肝細(xì)胞總數(shù)量減少，肝細(xì)胞出現(xiàn)體積增大、增殖能力下降等衰老特征[3,4]。D-半乳糖皮下注射可導(dǎo)致大鼠肝損傷，模擬衰老致肝損傷的病理過(guò)程。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類能在體外分化、增殖，具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。有學(xué)者[5～7]認(rèn)為通過(guò)移植間充質(zhì)干細(xì)胞，可以補(bǔ)充受損的肝細(xì)胞，修復(fù)肝臟組織。為此，本研究觀察了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞尾靜脈注射治療D-半乳糖致肝損傷大鼠的效果，并初步探討其可能機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 健康清潔級(jí)SD大鼠30只，體質(zhì)量180～230 g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(動(dòng)物編號(hào)SYXK閩2012-0001)。DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，D-半乳糖(Sigma公司)，TRIzol試劑(Invitrogen公司)，胰蛋白酶(Amresco公司)，PCR試劑(Promega公司)，倒置顯微鏡(Olympus公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Formo公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州集團(tuán)安泰公司)，酶標(biāo)儀(Bio-RAD型)。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取、培養(yǎng)和標(biāo)記 取6周齡SD大鼠，無(wú)菌取出股骨，PBS沖洗骨髓腔，轉(zhuǎn)入離心管，1 200 r/min離心10 min。加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，原代細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿培養(yǎng)瓶80%時(shí)，以胰酶消化成單細(xì)胞懸液，傳代。將第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，待生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，加入含有綠色熒光蛋白(GFP)的腺病毒上清液，共培養(yǎng)2 h。再更換為DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h，在熒光顯微鏡下觀察到明顯綠色熒光為標(biāo)記成功。

1.3 動(dòng)物分組、模型建立及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和治療組，各10只。飼養(yǎng)條件：溫度20～25 ℃，濕度60%～80%，自然照明，動(dòng)物自由飲水進(jìn)食。模型組和治療組大鼠以連續(xù)4個(gè)月皮下注射D-半乳糖的方法成功制備大鼠肝損傷模型。治療組大鼠造模成功后尾靜脈注射3×106個(gè)用GFP標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞。對(duì)照組注射同等劑量的生理鹽水。繼續(xù)飼養(yǎng)3 d。

1.4 肝組織骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分布觀察 麻醉處死大鼠，取出肝臟組織，制作冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察肝組織中綠色熒光分布情況。

1.5 肝組織形態(tài)學(xué)觀察 麻醉處死各組大鼠，每只取左肝前葉，置于10%甲醛溶液中浸泡固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察各組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)。

1.6 肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測(cè) 取各組大鼠肝組織約200 mg，加生理鹽水制備成10%勻漿。離心后取上清，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA，操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 肝組織中p53、p21 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。P53基因上游引物序列為5′-CCATCATCACGCTGGAAGACT-3′，下游引物序列為5′-TCCTCTGTCCGACGGTCTCTC-3′；P21基因上游引物序列為5′-AGGACTCTGAAGATGTGCCT-3′，下游引物序列為5′-TCGTCAACACCCTGTCTTGT-3′。以β-actin為內(nèi)參。以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8 血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測(cè) 取各組大鼠頸動(dòng)脈血，分離血清，分裝入1.5 mL離心管中。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清AST、ALT，操作按儀器說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 治療組大鼠肝組織中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分布情況 治療組大鼠尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后3 d，熒光顯微鏡下可見(jiàn)帶綠色熒光的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞散在于肝臟內(nèi)。

2.2 各組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)變化 光鏡下觀察，對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核大而圓，肝小葉結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠肝組織可見(jiàn)明顯水腫，細(xì)胞邊緣不完整，肝索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，出現(xiàn)明顯炎性損傷。與模型組比較，治療組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，病理?yè)p傷減輕。

2.3 各組大鼠肝組織中SOD、MDA水平比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織中SOD水平降低，MDA水平升高(P均<0.05)。與模型組相比，治療組大鼠肝組織SOD水平升高，MDA水平降低(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肝組織中SOD、MDA、p53 mRNA、p21 mRNA表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，△P<0.05。

2.4 各組大鼠肝組織中p53、p21 mRNA表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織中p53、p21 mRNA相對(duì)表達(dá)量增高(P均<0.05)。與模型組相比，治療組大鼠肝組織中p53、p21 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.5 各組大鼠血清ALT、AST水平比較 對(duì)照組、模型組、治療組血清ALT水平分別為(76.51±9.47)、(164.88±20.35)、(86.23±11.19)U/L，AST水平分別為(59.33±6.28)、(125.16±12.04)、(61.51士8.37)U/L。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清ALT、AST水平升高(P均<0.05)。與模型組相比，治療組大鼠血清ALT、AST水平降低(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

3 討論

衰老是多細(xì)胞生物隨時(shí)間推移出現(xiàn)的不可逆性細(xì)胞功能喪失[8]。肝臟是個(gè)體衰老過(guò)程中最易受累的器官之一，肝臟組織結(jié)構(gòu)會(huì)隨著年齡的增加而發(fā)生變化。肝臟主要依賴氧化代謝提供能量來(lái)源。根據(jù)氧化應(yīng)激衰老學(xué)說(shuō)，老化后肝臟的線粒體呼吸復(fù)合物出現(xiàn)功能障礙，導(dǎo)致DNA氧化損傷，而自由基損傷及肝細(xì)胞凋亡均導(dǎo)致肝臟代謝能力下降[9]。目前為止，因衰老導(dǎo)致的肝損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，亦缺乏特效的治療藥物。

研究發(fā)現(xiàn)，肝臟的體積和肝細(xì)胞數(shù)目會(huì)隨年齡增加而減少，男性平均肝臟質(zhì)量為1 040 g左右，隨著年齡增大呈近似直線下降，90歲時(shí)可降低到約700 g[10]。在小鼠中，肝臟細(xì)胞總數(shù)隨著鼠齡增加而下降[11,12]。衰老肝細(xì)胞的增殖能力隨之降低，32月齡小鼠肝細(xì)胞增殖能力僅有2月齡小鼠的三分之一[12]。在部分肝切除術(shù)后，老年患者肝細(xì)胞再生速率明顯慢于年輕個(gè)體的肝細(xì)胞。

隨著年齡的增長(zhǎng)，抗氧化酶的活性呈下降趨勢(shì)，大量的自由基未能及時(shí)清除，導(dǎo)致自由基在體內(nèi)堆積，引發(fā)一系列自由基反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法維持正常代謝。過(guò)多的D-半乳糖可使機(jī)體和細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的自由基，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[15,16]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織SOD水平降低，MDA水平升高，血清ALT、AST水平升高；光鏡下觀察肝組織可見(jiàn)明顯水腫，細(xì)胞邊緣不完整，肝索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，出現(xiàn)明顯炎性損傷，提示模型組大鼠已出現(xiàn)明顯的肝損傷。

間充質(zhì)干細(xì)胞是組織工程理想的種子細(xì)胞，具有向多種細(xì)胞分化發(fā)育的潛能。近年研究[13,14]表明，間充質(zhì)干細(xì)胞能誘導(dǎo)形成肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞。另外，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子，包括生長(zhǎng)因子和趨化因子等，進(jìn)而通過(guò)這些細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞歸巢、修復(fù)損傷。本研究結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜注后3 d，大鼠肝組織內(nèi)即可觀察到發(fā)綠色熒光的細(xì)胞，提示通過(guò)尾靜脈注射的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠歸巢至肝臟組織。與模型組相比，治療組大鼠血清ALT、AST水平降低，肝細(xì)胞病理?yè)p傷減輕，表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜注可對(duì)抗D-半乳糖導(dǎo)致的肝損傷。與模型組相比，治療組大鼠肝組織中SOD水平升高、MDA水平降低，提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜注能抵抗氧自由基，減輕氧化應(yīng)激水平，從而加速肝損傷后肝細(xì)胞再生。

細(xì)胞周期的停止是細(xì)胞衰老的前提。p53-p21信號(hào)通路是主要的細(xì)胞衰老相關(guān)信號(hào)通路[17,18]。p53是一種應(yīng)激蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后表達(dá)上調(diào)，激活p21基因，阻止視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白磷酸化，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)行[19,20]。p21基因也是細(xì)胞周期進(jìn)程的抑制劑，隨著年齡增長(zhǎng)表達(dá)增加。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中p53、p21 mRNA相對(duì)表達(dá)量增高，表明p53、p21表達(dá)上調(diào)在衰老的進(jìn)行中發(fā)揮一定作用。而靜注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠抑制肝組織中p53、p21表達(dá)，延緩細(xì)胞衰老，這可能是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)抗D-半乳糖所致肝損傷的分子機(jī)制。

綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜注可以起到治療D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠肝損傷的效果，其機(jī)制可能與下調(diào)肝組織中p53、p21 mRNA表達(dá)及降低肝組織氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

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