轉染ELF5基因的人卵巢癌干細胞增殖、周期、凋亡及成瘤能力變化

謝肖磊，閆洪超

(1徐州醫科大學研究生院，江蘇徐州221002；2徐州醫科大學附屬醫院)

轉染ELF5基因的人卵巢癌干細胞增殖、周期、凋亡及成瘤能力變化

謝肖磊1，閆洪超2

(1徐州醫科大學研究生院，江蘇徐州221002；2徐州醫科大學附屬醫院)

目的 觀察轉染ELF5基因的人卵巢癌干細胞增殖、周期、凋亡及成瘤能力變化。方法 將人卵巢癌干細胞(具有CD133+、CD117+特征的人卵巢癌細胞株HO8910)分為重組質粒組、空質粒組和空白對照組，重組質粒組轉染真核細胞表達載體pcDNA3.1-ELF5+EGFP，空質粒組轉染空載質粒pcDNA3.1-EGFP，空白對照組不做轉染；分別于培養24、48、72、96 h后采用CCK-8法觀察細胞增殖能力，于培養48 h后采用流式細胞儀觀察細胞周期分布情況、測算細胞凋亡率，于培養48 h后采用Western blotting法檢測各組細胞中的p21、Caspase-3蛋白。將重組質粒組、空質粒組和空白對照組細胞分別接種于雌性裸鼠右腋窩皮下制作卵巢癌移植瘤，每組接種5只；待移植瘤形成后取腫瘤組織，測量腫瘤最大直徑及質量，測算細胞凋亡率，檢測細胞中的p21、Caspase-3蛋白。結果 重組質粒組培養24、48、72、96 h后細胞增殖能力較空質粒組和空白對照組明顯下降(P均<0.05)。重組質粒組中阻滯于G0/G1期的細胞比例、細胞凋亡率及細胞中p21、Caspase-3蛋白相對表達量均高于空質粒組和空白對照組(P均<0.05)。重組質粒組移植瘤最大直徑和腫瘤質量小于空質粒組、空白對照組(P均<0.05)。重組質粒組移植瘤組織中細胞凋亡率及p21、Caspase-3蛋白相對表達量高于空質粒組和空白對照組(P均<0.05)。結論 轉染ELF5基因的人卵巢癌干細胞增殖受抑制、細胞周期阻滯、細胞凋亡增多、成瘤能力減弱，機制可能與p21、Caspase-3蛋白表達上調有關。

卵巢癌；腫瘤干細胞；細胞周期；細胞凋亡；ELF5基因；細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3

卵巢惡性腫瘤是危害女性健康的婦科惡性腫瘤之一，以卵巢上皮性癌較多見，病死率居婦科惡性腫瘤的首位[1,2]。研究[3～5]顯示人卵巢癌的惡性增殖及浸潤轉移與卵巢癌干細胞密切相關。本課題組前期研究以人卵巢癌細胞株HO8910為對象，篩選出具有“腫瘤干細胞”特性的CD133+、CD117+細胞，發現該細胞體內成瘤能力顯著，自我更新和分化能力明顯，并具有多藥耐藥等腫瘤干細胞特征[6]。ELF5是Ets轉錄因子家族中具有上皮特異性的成員，可調控細胞增殖，參與腫瘤的發病[7,8]。本課題組前期研究[9]表明ELF5 mRNA在卵巢上皮性癌組織中呈低表達，其表達缺失與卵巢上皮性癌的發生、發展有關。為進一步探討ELF5在卵巢癌發生發展中的作用，本課題組成功構建了含有ELF5基因的真核細胞表達載體pcDNA3.1- ELF5+EGFP，將其體外轉染至卵巢癌干細胞[10]，觀察轉染ELF5基因的人卵巢癌干細胞增殖、周期、凋亡及成瘤能力變化，并探討其可能機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物與主要材料 人卵巢癌干細胞(紫杉醇培養法篩選出具有CD133+、CD117+特征的人卵巢癌細胞株HO8910)由本課題組保存，接種至含有EGF、bFGF、Noggi及LIF的無血清培養基，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫密閉培養箱內傳代培養；鼠齡4～6周的NOD/SCID雌性裸鼠15只，在45%～50%恒濕、25～27 ℃恒溫、無特異性病原體的層流環境中飼養，飼料和水等經高壓消毒滅菌后供小鼠自由攝入，定期更換墊料；pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核細胞表達載體由本課題組構建并保存；CCK-8為日本Dojindo公司產品；Liptapfector脂質體轉染試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒、引物合成由日本TaKaRa公司提供；細胞周期試劑盒、Annexin V-PE/7-AAD、TUNEL檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司；ELF5一抗購自美國Chemicon公司；NOD/SCID雌性裸鼠(鼠齡4～6周)由中國科學院上海實驗動物中心提供。

1.2 細胞分組及ELF5基因轉染 將人卵巢癌干細胞分為重組質粒組、空質粒組和空白對照組。重組質粒組采用脂質體轉染法轉染真核細胞表達載體pcDNA3.1-ELF5+EGFP，具體操作步驟按Liptapfector2000脂質體轉染試劑盒說明書進行；空質粒組轉染空載質粒pcDNA3.1-EGFP；空白對照組不做轉染處理。通過倒置熒光顯微鏡拍照分析，轉染48 h時細胞中GFP陽性表達率最高。用G418篩選穩定轉染48 h的細胞，進一步擴增培養。采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞中的ELF5 mRNA，以β-actin為內參，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量，重組質粒組細胞中ELF5 mRNA相對表達量為3.11±0.71,高于空質粒組的1.30±0.56和空白對照組的1。

1.3 細胞增殖觀察 取三組細胞懸液，以5×104/mL分別接種于96孔板，每組細胞設6個復孔，周圍加PBS防蒸發，置于37 ℃、5% CO2環境下分別培養24、48、72、96 h后加入10 μL的CCK-8試劑，另設無細胞空白孔加相同試劑，避光操作，再繼續培養1 h后置于酶標儀上，在450 nm波長處測OD值。實驗重復3次，取均值，以實驗組OD值/空白組OD值表示細胞增殖能力。

1.4 細胞周期分布觀察 于培養48 h后收集三組細胞，PBS洗滌、離心后調整細胞濃度為1×106/mL，70%乙醇固定，PBS洗滌后分別加100 μL的RNase A、400 μL的PI染色混勻，最后上流式細胞儀檢測，記錄激發波長488 nm處紅色熒光。實驗重復3次，用Modfi T軟件分析細胞周期分布情況。

1.5 細胞凋亡率測算 于培養48 h后收集三組細胞，用不含EDTA的胰酶消化處理，經PBS洗滌、離心后收集(1～5)×105個細胞，分別加入Binding Buffer混勻的7-AAD、Annexin V-PE染液(按Annexin V-PE/7-AAD雙染試劑盒說明書操作)，最后上流式細胞儀測算細胞凋亡率。

1.6 細胞中p21、Caspase-3蛋白檢測 于培養48 h后取生長期的三組細胞，置于細胞裂解液(200 μL)中冰上裂解，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后，進行轉膜實驗，脫脂奶粉封閉，加入1∶1 000的兔抗人ELF5單克隆抗體一抗，4 ℃過夜，與1∶10 000的羊抗兔二抗室溫下反應，加入化學發光試劑，最后進行曝光、顯影劑掃描并保存圖片，用Image J圖像軟件進行灰度分析，以空白對照組灰度值為參考，對目的蛋白相對表達量進行標準化。

1.7 細胞成瘤能力觀察

1.7.1 卵巢癌裸鼠移植瘤的制作 取“1.2”中所得的三組細胞懸液，按2×104/mL濃度分別接種于裸鼠右腋窩皮下，每組接種5只，每周2次觀察腫瘤生長情況。

1.7.2 移植瘤直徑及質量測量 各組成瘤后取腫瘤組織，測量腫瘤最大直徑及質量。對瘤組織行病理檢查以證實其致瘤性。

1.7.3 移植瘤組織中細胞凋亡率測算 取三組移植瘤組織切片，60 ℃烘烤后經二甲苯脫蠟、乙醇水合、1% TritonX-100通透液促滲、3% H2O2甲醛封閉、蛋白酶K孵育等一系列處理，以DNase1孵育，加入TdT酶反應液、Streptavidin-HRP工作液、DAB顯色液，重復吸干組織周圍水分，蘇木素復染，1%鹽酸甲醇分化，飽和碳酸鋰返藍，再以梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，按TUNEL檢測試劑盒說明書操作，鏡下計數凋亡細胞并計算細胞凋亡率。

1.7.4 移植瘤組織中p21、Caspase-3蛋白檢測 采用Western blotting法，操作參考“1.6”，用Image J圖像軟件分析結果，并計算目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較 重組質粒組培養24、48、72、96 h后細胞增殖能力分別為0.88±0.03、1.09±0.04、1.24±0.04、1.37±0.03，空質粒組分別為1.08±0.03、1.27±0.04、1.58±0.04、1.90±0.01，空白對照組分別為1.10±0.06、1.29±0.04、1.53±0.03、1.92±0.02，重組質粒組不同培養時間細胞增殖能力較空質粒組和空白對照組明顯下降(P均<0.05)。

2.2 各組細胞周期分布比較 重組質粒組中阻滯于G0/G1期的細胞比例(68.50%±0.50%)高于空質粒組(40.73%±0.35%)及空白對照組(40.87%±0.23%)，P均<0.05。

2.3 各組細胞凋亡率比較 重組質粒組細胞凋亡率(39.98%±0.97%)高于空質粒組(19.01%±1.37%)及空白對照組(17.05%±1.45%)，P均<0.05。

2.4 各組細胞中p21、Caspase-3蛋白表達比較 重組質粒組、空質粒組及空白對照組中p21蛋白相對表達量分別為10.81±0.67、1.38±0.46、1.13±0.35，Caspase-3蛋白相對表達量分別為7.31±0.54、0.97±0.46、1.08±0.55，重組質粒組細胞中p21、Caspase-3蛋白相對表達量高于空質粒組及空白對照組(P均<0.05)。見圖1。

注：A為重組質粒組；B為空質粒組；C為空白對照組。

圖 1 各組細胞中p21、Caspase-3蛋白表達比較

2.5 各組移植瘤最大直徑及腫瘤質量比較 重組質粒組、空質粒組、空白對照組移植瘤最大直徑分別為(8.06±0.54)、(15.17±0.82)、(16.09±0.25)mm，腫瘤質量分別為(0.47±0.26)、(1.08±0.67)、(1.13±0.73)g，重組質粒組移植瘤最大直徑和腫瘤質量均小于空質粒組、空白對照組(P均<0.05)。

2.6 各組移植瘤組織細胞凋亡率比較 TUNEL法檢測結果顯示，重組質粒組、空質粒組、空白對照組移植瘤組織中細胞凋亡率分別為53.26%±0.54%、24.17%±1.82%、22.09%±0.75%，重組質粒組移植瘤組織中細胞凋亡率高于空質粒組和空白對照組(P均<0.05)。見圖2。

注：A為重組質粒組；B為空質粒組；C為空白對照組。

圖2 三組移植瘤組織中細胞凋亡情況比較

2.7 各組移植瘤組織中p21、Caspase-3蛋白表達比較 重組質粒組、空質粒組及空白對照組移植瘤組織中p21蛋白相對表達量分別為7.41±0.52、1.12±0.63、1.08±0.49，Caspase-3蛋白相對表達量分別為9.71±0.74、1.05±0.76、0.98±0.45，重組質粒組移植瘤組織中p21、Caspase-3蛋白相對表達量高于空質粒組及空白對照組(P均<0.05)。見圖3。

3 討論

卵巢癌因其發病部位隱匿、發病機制復雜，早期診斷困難，治療效果欠佳，病死率較高，嚴重威脅婦女健康[11,12]。卵巢癌侵襲轉移和術后復發是多數卵巢癌患者死亡的主要原因。不同腫瘤發生轉移的機制雖有共性，但亦有特異的信號通路機制[13～15]。因此，研究及闡明卵巢癌侵襲轉移的特異性機制，并針對性地設計相應治療對策，對提高卵巢癌的臨床治療效果和改善患者生存率具有非常重要的意義[16,17]。卵巢癌干細胞理論認為卵巢癌是一種干細胞疾病[3～5]。本課題組前期研究篩選出人卵巢癌干細胞，其體內成瘤能力顯著，自我更新和分化能力明顯，具有腫瘤干細胞特征[6]。

注：A為重組質粒組；B為空質粒組；C為空白對照組。

圖3 各組移植瘤組織中p21、Caspase-3蛋白表達比較

ELF5是Ets轉錄因子家族中具有上皮特異性的成員，可調控細胞增殖，參與腫瘤的發病[7,8]。ELF5基因位于人11號染色體短臂13～15區，此區域在癌癥患者中易發生雜合性丟失。ELF5含有E1、E2兩個可識別結構域，一個能夠與TTCC核心序列結合的基序和一個參與蛋白間相互作用的E3結構域[18,19]。Yan等[20]研究表明ELF5中的E3結構域富含脯氨酸，具有與蛋白質結合的功能，而E2結構域中S208的磷酸化水平是決定ELF5活性的關鍵因素之一。ELF5在細胞發育、分化和凋亡過程中扮演關鍵角色，并可調控細胞增殖，參與腫瘤發病。本課題組前期研究[9]表明ELF5 mRNA在卵巢上皮性癌組織中呈低表達，其表達缺失與卵巢上皮性癌的發生、發展有關。

為進一步從多方面研究ELF5基因干預對人卵巢癌細胞增殖、周期、凋亡及成瘤能力的影響，本課題組將pcDNA3.1- ELF5+EGFP轉染人卵巢癌干細胞，同時以轉染空載質粒pcDNA3.1-EGFP及未經轉染的人卵巢癌干細胞作為對照，細胞體外實驗結果顯示，重組質粒組培養24、48、72、96 h后細胞增殖能力較空質粒組和空白對照組明顯下降，重組質粒組中阻滯于G0/G1期的細胞比例、細胞凋亡率及細胞中p21、Caspase-3蛋白相對表達量均高于空質粒組和空白對照組。上述結果表明ELF5基因可抑制人卵巢癌干細胞增殖，阻滯其細胞周期，誘導細胞凋亡，機制可能與調控p21、Caspase-3蛋白表達有關。同時，本研究還將三組細胞分別接種于裸鼠體內構建人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，從體內實驗驗證ELF5基因對卵巢癌細胞增殖、周期、凋亡及成瘤能力的影響。相關研究結果顯示，重組質粒組移植瘤最大直徑和腫瘤質量小于空質粒組、空白對照組，重組質粒組移植瘤組織中細胞凋亡率及p21、Caspase-3蛋白相對表達量高于空質粒組和空白對照組。上述結果提示ELF5基因在體內對人卵巢癌干細胞同樣有抑制增殖、阻滯細胞周期、促進凋亡的作用，并能夠減弱卵巢癌干細胞的成瘤能力。ELF5基因調控凋亡蛋白表達的機制可能與其自身E3結構域有關。因為研究已證實ELF5基因中E3結構域富含脯氨酸，其具有和蛋白質結合的功能，故我們推測ELF5基因可能通過與人卵巢癌干細胞的蛋白質結合并相互作用，上調人卵巢癌干細胞中的細胞周期調控蛋白p21及凋亡調控因子Caspase-3的表達，從而抑制細胞增殖、阻滯細胞周期、促進細胞凋亡，同時減弱人卵巢癌干細胞的成瘤能力。

本研究通過一系列體外及體內實驗證實，轉染ELF5基因的人卵巢癌干細胞增殖受抑制、細胞周期阻滯、細胞凋亡增多、成瘤能力減弱，ELF5基因對人卵巢癌干細胞增殖、周期及成瘤能力有明顯影響，其機制可能與上調p21、Caspase-3蛋白表達有關。本研究結果為ELF5基因用于卵巢癌的基因治療奠定了實驗基礎，但相關研究目前尚處于初級階段，仍需進一步展開探索。

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閆洪超(E-mail: 1015058194@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.009

R737.31

A

1002-266X(2017)03-0032-04

2016-10-18)