SMG-1基因對缺氧卵巢癌細胞SKOV3增殖、凋亡的影響及其機制

張展，宋華，杜尚珂，石瑛，朱海

(1鄭州大學第三附屬醫院，鄭州450052；2商丘醫學高等專科學校)

·基礎研究·

SMG-1基因對缺氧卵巢癌細胞SKOV3增殖、凋亡的影響及其機制

張展1,2，宋華1，杜尚珂1，石瑛1，朱海1

(1鄭州大學第三附屬醫院，鄭州450052；2商丘醫學高等專科學校)

目的 觀察缺氧狀態下卵巢癌SKOV3細胞中生殖器形成抑制基因1(SMG-1)的表達變化，及沉默SMG-1對SKOV3細胞增殖、凋亡的影響，并探討其機制。方法 培養卵巢癌SKOV3細胞，分為常氧組和缺氧組，其中缺氧組以終濃度150 μmol/L的二氯化鈷進行缺氧處理；48 h后分別采用qRT-PCR法和Western blotting法檢測SMG-1 mRNA、蛋白。取缺氧處理的SKOV3細胞分為A、B、C、D組，A組為空白對照，B組轉染陰性對照，C組僅加入轉染試劑，D組轉染SMG-1 siRNA。四組分別于轉染48 h后測算細胞增殖抑制率、凋亡率，采用qRT-PCR法檢測STAT3 mRNA，采用Western blotting法檢測STAT3、p-STAT3蛋白。結果 與常氧組相比，缺氧組SMG-1 mRNA及蛋白相對表達量升高(P均<0.05)。以A組為參照(0)，D組細胞增殖抑制率升高，與B、C組相比，P均<0.05。與其余3組相比，D組細胞凋亡率升高，STAT3 mRNA及蛋白、p-STAT3蛋白相對表達量降低(P均<0.05)。結論 缺氧狀態下卵巢癌SKOV3細胞中SMG-1表達上調；沉默SMG-1表達后SKOV3細胞增殖受到抑制、凋亡增多；SMG-1影響卵巢癌細胞增殖、凋亡的機制可能與改變STAT3的表達有關。

卵巢癌；生殖器形成抑制基因1；缺氧；細胞增殖；細胞凋亡；轉錄激活因子3

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，早期診斷非常困難，病死率高，發病機制尚不明確。研究[1]發現，作為一種實體腫瘤，卵巢癌組織內存在缺氧微環境，缺氧在卵巢癌進展過程中扮演至關重要的角色，可影響腫瘤細胞增殖、凋亡、分化、遷移等生物學行為。生殖器形成抑制基因1(SMG-1)是磷脂酰肌醇-3-激酶相關激酶(PIKKs)家族成員之一，參與無義介導的mRNA降解(NMD)途徑[2,3]。此外，SMG-1還參與細胞生長、增殖、缺氧及凋亡等多個生物進程，甚至可抑制腫瘤的進展[4～7]。本研究觀察了缺氧狀態下卵巢癌SKOV3細胞中SMG-1基因、蛋白的表達變化，及沉默SMG-1對SKOV3細胞增殖、凋亡的影響，并對其可能機制進行初步探索，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 人卵巢癌SKOV3細胞為本課題組保存；RPMI1640培養基購于HyClone生物制品公司；血清購于杭州四季青公司；SMG-1 siRNA購于廣東銳博生物公司；轉染試劑Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司；SMG-1(V72)抗體購于美國Cell Signaling公司；STAT3、p-STAT3抗體購于美國Abcam公司；qRT-PCR相關試劑購于日本TOYOBO公司；Annexin V/PI試劑盒購于美國BD公司；CCK-8試劑盒購于日本同仁研究所。

1.2 細胞培養及缺氧處理 SKOV3細胞在5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養，使用RPMI1640培養基(含10%胎牛血清)。待細胞對數生長期時經0.25%胰酶消化后以1.0×105/孔接種于6孔板中，細胞長滿50%～60%時開始缺氧處理。將細胞分為常氧組和缺氧組。缺氧組加入終濃度150 μmol/L的二氯化鈷，常氧組常規培養。48 h后分別采用qRT-PCR法和Western blotting法檢測SMG-1 mRNA、蛋白。

1.3 細胞分組及SMG-1沉默方法 取缺氧處理的SKOV3細胞(參照“1.2”處理方法)，缺氧24 h后分為A、B、C、D組。A組為空白對照，不加siRNA和Lipofectamine2000；B組加入空載siRNA(陰性對照)和Lipofectamine2000；C組僅加入Lipofectamine2000；D組加入SMG-1 siRNA和Lipofectamine2000。轉染6 h后更換完全培養基(含10%胎牛血清及150 μmol/L的二氯化鈷)，恒溫箱繼續培養48 h后分別經qRT-PCR法和Western blotting法驗證SMG-1 siRNA的沉默效果，D組SMG-1表達量明顯低于A、B、C組(P均<0.05)且D組與A組相比SMG-1表達抑制率>50%。

1.4 細胞增殖觀察 各組轉染48 h后更換新鮮培養基，再加入CCK-8試劑；此外另設一組不含細胞只有新鮮培養基和CCK-8的空白組(CCK-8試劑與培養基比例均為1∶10)；37 ℃避光孵育2 h后在波長450 nm處檢測各組吸光度(A)值。以(A對照組-A實驗組)/(A對照組-A空白組)計算各組細胞增殖抑制率。

1.5 凋亡細胞檢測 轉染48 h后用胰酶(不含EDTA)消化收集各組細胞，用冷的PBS洗滌細胞2次后加入500 μL的Binding Buffer重懸細胞，然后依次加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min后以流式細胞儀檢測凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

1.6 缺氧SKOV3細胞中轉錄激活因子3(STAT3) mRNA及蛋白檢測 TRIzol法分別提取A、B、C、D組細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒及qRT-PCR試劑的操作說明進行操作，檢測各組細胞中的STAT3 mRNA。STAT3基因上游引物序列為5′-AGGATAGAGATAGACCAGTGGAGAC-3′，下游引物序列為5′-TCAGTGAAAGCAAAGAAGG-3′，產物長度197 bp；內參基因β-actin上游引物序列為5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，下游引物序列為5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTC-3′，產物長度185 bp。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。RIPA法分別提取A、B、C、D組細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，每組蛋白上樣量40 μg。采用120 V恒壓進行SDS-PAGE電泳，濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(稀釋比例1∶1 000)4 ℃過夜，TBS洗滌后孵育二抗(稀釋比例1∶5 000)，TBST洗滌后通過ODYSSEY Clx檢測與成像系統進行結果分析，計算蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 缺氧組與常氧組SMG-1 mRNA、蛋白表達比較 缺氧組SMG-1 mRNA、蛋白相對表達量分別為4.19±0.94、0.58±0.11，常氧組分別為1.12±0.17、0.26±0.06。與常氧組相比，缺氧組SMG-1 mRNA及蛋白相對表達量升高(P均<0.05)。

2.2 A、B、C、D組細胞增殖抑制率、凋亡率比較 以A組為參照(0)，D組細胞增殖抑制率高于B、C組(P均<0.05)。D組細胞凋亡率高于其余3組(P均<0.05)。詳見表1。

表1 四組細胞增殖抑制率、凋亡率比較±s)

注：與B、C組比較，*P<0.05；與A、B、C組比較，△P<0.05。

2.3 A、B、C、D組細胞中STAT3 mRNA及蛋白表達比較 與其余三組相比，D組STAT3 mRNA及蛋白、p-STAT3蛋白相對表達量降低(P均<0.05)。詳見表2。

表2 四組細胞中STAT3 mRNA及蛋白、p-STAT3蛋白相對表達量比較±s)

注：與A、B、C組比較，*P<0.05。

3 討論

近年研究發現，實體腫瘤內部細胞往往處于不同程度的缺氧狀態，缺氧微環境與腫瘤的進展密切相關，卵巢癌也是如此。SMG-1作為一種新型的腫瘤相關因子引起了越來越多學者的關注。研究[6]顯示，缺氧條件下SMG-1可被激活且對HIF-1α有負向調節作用。本研究采用二氯化鈷對人卵巢癌SKOV3細胞進行缺氧處理，發現缺氧狀態下SKOV3細胞中SMG-1表達水平升高，提示缺氧可誘導SMG-1表達，與相關研究結果一致，而缺氧誘導SMG-1表達的相關機制尚需進一步探索。

多項研究發現SMG-1與多種細胞系的凋亡有關，如沉默SMG-1后人骨肉瘤U2OS細胞凋亡明顯增多[8]，SMG-1可通過保持秀麗隱桿線蟲體內細胞端粒完整性從而抵抗細胞凋亡[2]，抑制SMG-1表達可促使人絨毛膜癌JAR細胞系發生凋亡[9]，在頭頸部鱗癌、肝細胞癌、胰腺癌等的相關研究也得出了類似結論[10～15]。綜合已有的研究結果可看出，SMG-1的功能在不同種屬間及不同細胞間可能具有多元性和復雜性。為研究缺氧狀態下SMG-1對人卵巢癌SKOV3細胞增殖、凋亡的影響，我們設計si-RNA沉默SMG-1表達后，發現SKOV3細胞增殖抑制率和凋亡率增高，推測在缺氧微環境下SMG-1可能有抑制卵巢癌細胞凋亡的作用，而沉默SMG-1可促進缺氧的SKOV3細胞凋亡。

已有研究[5,15]證實，SMG-1可通過抑制TNF-α誘導的細胞凋亡通路來抑制細胞凋亡。有學者[11,16]發現，SMG-1能通過抑制mTOR通路調控細胞生長，其中mTOR可通過調節凋亡蛋白表達從而調控細胞凋亡。為進一步探究SMG-1對SKOV3細胞凋亡的影響機制，本研究檢測了SKOV3細胞中凋亡相關因子STAT3基因及蛋白。STAT家族包括7個成員(STAT1～STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6)，其中對STAT3的研究較為深入。STAT3在不同因子刺激下可發生絲氨酸(Ser727)或酪氨酸(Tyr705)殘基位點的磷酸化，形成p-STAT3，進而形成二聚體轉入細胞核內，發揮一系列精密的調控作用。STAT3在包括卵巢癌在內的很多人類腫瘤中可被持續性激活且具有抗凋亡活性[17,18]。有研究[19]發現，阻斷JAK2/STAT3可通過線粒體凋亡通路誘導細胞發生凋亡。在卵巢癌細胞系中，沉默STAT3可使細胞增殖受抑制、凋亡增加[20]。本研究結果顯示，沉默SMG-1的SKOV3細胞中STAT3 mRNA、STAT3蛋白、p-STAT3蛋白相對表達量下調，表明SMG-1在參與細胞凋亡過程中還可對其他凋亡相關因子表達產生影響，推測SMG-1對細胞凋亡的作用可能與改變STAT3的表達有關，但這需要后續實驗進行驗證。

綜合本次研究結果，我們認為，缺氧可誘導卵巢癌SKOV3細胞中SMG-1表達上調，而沉默SMG-1表達后SKOV3細胞增殖受抑制、凋亡增多，推測SMG-1對卵巢癌細胞的促凋亡作用機制可能與影響STAT3表達有關。

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張展(E-mail： zhangzhanzdsfy@126.com)

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2016-09-25)