桑蠶繭絲素蛋白肽對大鼠離體過氧化肝組織的修復及對小鼠過氧化肝損傷的預防作用觀察

王美颯，黃慧明，朱仲玲，杜怡波，杜雙雙，趙紅平，閻昭

(1天津醫科大學腫瘤醫院，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060；2清華大學生物力學與醫學工程研究所)

桑蠶繭絲素蛋白肽對大鼠離體過氧化肝組織的修復及對小鼠過氧化肝損傷的預防作用觀察

王美颯1，黃慧明2，朱仲玲1，杜怡波1，杜雙雙1，趙紅平2，閻昭1

(1天津醫科大學腫瘤醫院，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060；2清華大學生物力學與醫學工程研究所)

目的 觀察桑蠶繭絲素蛋白肽(SFP)對大鼠離體過氧化肝組織的修復作用及對小鼠過氧化肝損傷的預防作用。方法 ①SFP對離體大鼠過氧化肝組織抗氧化作用觀察：Sprague-Dawley大鼠3只，處死后制備肝微粒體，加入抗壞血酸和亞鐵離子溶液誘導過氧化后分為5個組，實驗1、2、3組分別加入10、15、30 μg/mL的SFP，陽性對照組加入10 μg/mL的抗氧化劑BHT，空白對照組加入PBS緩沖液；37 ℃水浴孵育2 h后檢測丙二醛(MDA)，計算各組過氧化抑制率。②SFP對小鼠過氧化肝損傷的干預作用觀察：選取BALB/c健康成年小鼠50只，隨機分為A、B、C、D、E組。A、B、C組分別注射37.5、75、112.5 mg/kg的SFP、1次/d，D組注射生理鹽水、1次/d，E組常規飼養；給藥33 d后將小鼠饑餓過夜，按上述方法給藥0.5～1 h后，A、B、C、D組以溴代苯油灌胃制作過氧化肝損傷模型，24 h后處死5組動物，取小鼠肝組織，檢測血清及肝組織中的MDA、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)。在實驗過程中，每天記錄小鼠體質量，觀察小鼠精神、飲食及活動狀況。結果 實驗1、2、3組及陽性對照組肝組織中MDA含量均低于空白對照組，且實驗1、2、3組肝組織中MDA含量逐漸降低(P均<0.05)。實驗1、2、3組脂質過氧化抑制率逐漸升高，且均低于陽性對照組(P均<0.05)。A、B、C組血清及肝組織中MDA含量低于D、E組，SOD、GSH-Px活性高于D、E組；A、B、C組血清及肝組織中MDA含量逐漸降低，SOD、GSH-Px活性逐漸升高(P均<0.05)。實驗過程中，小鼠均未出現消瘦、精神萎靡甚至死亡的情況。結論 SFP對大鼠離體過氧化肝組織有修復作用，并可預防小鼠過氧化肝損傷，作用呈一定劑量相關性，其機制可能與減少過氧化產物生成、提高抗氧化酶活性有關。

桑蠶繭；絲素蛋白肽；過氧化肝損傷；丙二醛；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶

桑蠶繭是由家蠶吐絲結繭而成的一種傳統中藥材，其絲膠蛋白含量約25%，絲素蛋白含量約75%。《本草綱目》描述桑蠶繭氣味為甘、溫、無毒，現代藥理研究[1～6]表明其具有明確的抗腫瘤、防血栓、降血壓、降血糖和擬膽堿作用，如寶心艾維西木口服液(治療心血管疾病)、復方西紅花口服液(養心溫胃、補腎強身)及復方高滋斑片(強心健腦、安神通脈)中均含有桑蠶繭。為進一步拓展桑蠶繭的臨床應用，研究者逐步關注桑蠶繭的抗氧化活性。已有研究[7]表明，桑蠶繭中絲膠蛋白具有良好的抗氧化活性，而對于桑蠶繭中含量較高的絲素蛋白的抗氧化活性目前鮮有報道。基于此，我們制備了高純度、高濃度的絲素蛋白肽(SFP)，觀察SFP對大鼠離體過氧化肝組織的修復作用及對小鼠過氧化肝損傷的預防作用，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要材料 實驗動物：雄性一級Sprague-Dawley大鼠3只，體質量180～220 g；雄性BALB/c小鼠50只、體質量18～22 g，許可證號SCXK(京)2011-0011，在SPF級動物房飼養。藥物與試劑：SFP，生理鹽水，蔗糖，Tris，鹽酸，PBS緩沖液(pH 7.4)，三氯醋酸(TCA)，抗壞血酸(維生素C)，FeSO4·7H2O，2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)，2,2′-二苯基-1-苦肼基(DPPH)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒。儀器：酶標儀，低溫高速離心機。

1.2 SFP對大鼠離體過氧化肝組織的修復作用觀察

1.2.1 大鼠過氧化肝組織制作及SFP的應用 將3只Wistar雄性大鼠禁食不禁水過夜，斷頭處死，待血液放盡后立即取出全部肝臟，用預冷的生理鹽水清洗血污，濾紙吸干，將肝臟稱重后剪碎；每1 g肝臟加入4 mL預先配好的0.25 mol/L的蔗糖-Tirs-HCl緩沖液(pH 7.4)，用勻漿機勻漿肝臟，用差速離心法制備一級Sprague-Dawley大鼠肝微粒體沉淀，隨后加入0.15 mol/L的KCl，得到1 mg/mL的肝微粒混懸液；取5個潔凈離心管，在各管中加入0.8 mL的PBS緩沖液與0.2 mL的肝微粒懸液，37 ℃預孵育5 min；加入抗壞血酸和亞鐵離子溶液誘導肝微粒體發生過氧化。每管作為1個組，共5個組。實驗1、2、3組分別加入10、15、30 μg/mL的SFP 0.2 mL，陽性對照組加入10 μg/mL的抗氧化劑BHT 0.2 mL，空白對照組加入生理鹽水0.2 mL，繼續培養。

1.2.2 過氧化肝組織中MDA檢測及過氧化抑制率的測算 ①MDA檢測：各組肝組織放置在37 ℃水浴鍋內恒溫孵育2 h，將各管取出放置于冰盒中，加入10%的三氯乙酸溶液3 mL終止反應，冰浴15 min后取出，4 000 r/min下離心10 min，使用MDA試劑盒檢測MDA。②過氧化抑制率測算：在532 nm波長下檢測吸光度值，過氧化抑制率=(各組吸光度值/空白對照組吸光度值)×100%。

1.3 SFP對小鼠過氧化肝損傷的預防作用觀察 選取18～22 g BALB/c健康成年小鼠50只，隨機分為A、B、C、D、E組。A、B、C組分別注射37.5、75、112.5 mg/kg的SFP 0.2 mL、1次/d，D組注射生理鹽水0.2 mL、1次/d；E組常規飼養。給藥33 d后將小鼠饑餓過夜，按上述方法給藥0.5～1 h后，A、B、C、D組參考衛生部保健食品檢驗與評價技術規范(2003年版)中溴代苯模型制造方法制作過氧化肝損傷模型(給予0.45 mg/kg、20 mL/20 g溴代苯油灌胃)。24 h后處死5組動物，取小鼠肝組織，檢測血清及肝組織中的MDA、SOD、GSH-Px。在實驗過程中，每天用電子天平稱量并記錄小鼠的體質量，每天觀察小鼠的精神、飲食及活動狀況。

2 結果

2.1 SFP體外對大鼠肝組織的抗氧化作用 實驗1組、實驗2組、實驗3組、陽性對照組、空白對照組肝組織中MDA含量分別為(11.7±1.05)、(10.9±0.36)、(10.2±0.10)、(4.2±0.08)、(14.1±0.50)nmol/L。實驗1、2、3組及陽性對照組肝組織中MDA含量均低于空白對照組，且實驗1、2、3組肝組織中MDA的含量逐漸降低(P均<0.05)。實驗1組、實驗2組、實驗3組、陽性對照組脂質過氧化抑制率分別為17%、23%、28%、84%，實驗1、2、3組脂質過氧化抑制率逐漸升高，且均低于陽性對照組(P均<0.05)。

2.2 SFP對小鼠過氧化肝損傷的干預作用 各組小鼠血清及肝組織中MDA含量及SOD、GSH-Px活性比較見表1。A、B、C組血清及肝組織中MDA含量低于D、E組(P均<0.05)。A、B、C組血清及肝組織中SOD、GSH-Px活性高于D、E組(P均<0.05)。小鼠體質量變化見表2。A、B、C組組內無統計學差異。在第34天，各小鼠體質量較前有所下降。實驗過程中，各組小鼠生長狀態良好，精神飽滿，正常飲食，無其他不良反應出現。

表1 各組小鼠血清及肝組織中MDA含量及SOD、GSH-Px活性比較

注：與E組比較，*P<0.05；與D組相比，#P<0.05。

表2 各組小鼠實驗第1～35天體質量變化

3 討論

近年來國內桑蠶產繭量連續遞增[8]，桑蠶繭原料極其豐富。桑蠶繭主要由絲素蛋白和絲膠蛋白組成，其中絲素蛋白是桑蠶繭蠶絲蛋白的主要組成部分，約占蛋白總量的70%。桑蠶繭絲素蛋白可通過水解或酶解等方法降解為SFP。SFP被廣泛應用到醫藥、食品與化妝品等領域[9]。隨著研究不斷深入，學者們逐漸發現SFP的抗氧化、抗腫瘤的潛在藥用價值。

現代藥理學研究表明，心血管疾病等慢性疾病與自由基、脂質過氧化等有密切關系[10]。自由基是人體正常代謝產物，機體主要通過呼吸鏈內氧化磷酸途徑、精氨酸-NO合成酶途徑、黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶途徑等多條反應途徑產生自由基[11]。生理情況下，人體內存在的少數自由基可促進嗜酸性細胞殺滅細菌，控制炎癥反應[11]，且機體內產生的自由基可被抗氧化防御系統有效清除，以維持自由基產生與消除的動態平衡。病理情況下，機體內由于自由基聚集，會發生脂質過氧化反應，誘導細胞凋亡及各種慢性疾病的產生，如關節炎[12]、糖尿病[13]、高血壓、惡性腫瘤等[14,15]。

氧自由基是造成肝損傷的最常見原因之一，氧自由基可進攻生物膜中的多種不飽和脂肪酸，從而引起脂質過氧化反應，生成MDA等脂質過氧化物，MDA是細胞脂質過氧化反應的標志物，可以間接反映細胞及組織損傷的程度[16]。MDA可誘導膜系統發生脂質過氧化反應，使膜磷脂大量降解，從而破壞生物膜結構的完整性，引起膜通透性增高，最終導致細胞死亡，造成肝損傷。SOD和GSH-Px是生物體內重要的抗氧化酶，也是評估肝臟抗氧化水平的重要指標。SOD的生物學作用是清除超氧化物自由基，它是體內惟一可以消耗超氧化物自由基的酶，也是機體清除自由基的第一道防線[17]。當機體產生大量自由基時，體內會生成大量SOD，從而提高機體處理自由基的能力，抑制過氧化反應[18]。GSH-Px的主要生物學作用是清除脂質過氧化物、防止畸變等[19]。因此，本研究建立過氧化肝損傷模型，通過檢測MDA、SOD和GSH-Px，驗證SFP的抗氧化作用[20]。

本研究首先觀察了SFP對離體過氧化肝組織的抗氧化活性，結果顯示，實驗1、2、3組及陽性對照組肝組織中MDA含量低于空白對照組，實驗1、2、3組肝組織中MDA含量高于陽性對照組；實驗1、2、3組脂質過氧化抑制率及自由基清除率低于陽性對照組，實驗1、2、3組脂質過氧化抑制率及自由基清除率逐漸升高。上述結果提示SFP可減少脂質過氧化產物MDA生成，并能提高氧自由基的清除率，且呈量效關系；SFP的體外抗氧化能力遜于BHT，但BHT對人體有害，而SFP為無毒級，生物安全性遠優于BHT。

在體內實驗中，我們以溴代苯誘導建立過氧化肝損傷小鼠模型來驗證SFP的抗氧化功能。溴代苯可導致小鼠肝中毒，引起肝脂質過氧化。本研究結果顯示，A、B、C組血清及肝組織中MDA含量低于D、E組，SOD、GSH-Px活性高于D、E組；A、B、C組血清及肝組織中MDA含量逐漸降低，SOD、GSH-Px活性逐漸升高。這說明SFP可減輕過氧化肝損傷程度，減少MDA生成，提高SOD、GSH-Px活性，且具有一定的量效關系。在實驗過程中，小鼠均未出現消瘦、精神萎靡甚至死亡的情況，表明SFP體內應用較安全。

上述研究結果表明，SFP對大鼠離體過氧化肝組織有修復作用，并可預防小鼠過氧化肝損傷，其機制可能與減少過氧化產物生成、提高抗氧化酶活性有關。這為中藥材桑蠶繭臨床干預或治療糖尿病、高血壓、心血管等疾病提供了實驗基礎。然而，SFP的具體作用機制還有待深入研究，SFP的臨床應用及其確切效果仍需更多探索和驗證。

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Effects of silk protein polypeptides of silkworm cocoon on repairing isolated oxidative livertissues in rats and its preventive effect on oxidative liver injury in mice

WANGMeisa1,HUANGHuiming,ZHUZhongling,DUYibo,DUShuangshuang,ZHAOHongping,YANZhao

(1TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,KeyLaboratoryofCancerPreventionandTherapy,Tianjin300060,China)

Objective To observe the effect of silk protein polypeptides of silkworm cocoon (SFP) on repairing oxidative liver tissues in rats and its preventive effect on oxidative liver injury in mice.Methods ①Anti-oxidation effect of SFP on the isolated rat liver: three Sprague-Dawley rats were sacrificed and prepared the liver microsomes, after adding ascorbic acid and ferrous ion solution to induce oxidation, they were divided into 5 groups, 0.2 mL SPF was added to the experimental groups 1, 2 and 3 with concentrations of 10, 15 and 30 μg/mL, respectively, the equal amount of 10 μg/mL antioxidant BHT and distilled water were added to the positive control group and blank control group, respectively. We measured the content of MDA and calculated the inhibition rate of oxidation after incubation in 37 ℃ water for 2 h. ② Intervention effect of SFP on liver injury induced by oxidation in mice: Fifty healthy BALB/C mice were randomly divided into groups A, B, C, D and E. Mice in the groups A, B and C were injected with 37.5, 75 and 112.5 mg/kg SFP once a day; mice in the group D were injected with normal saline once a day and in group E were fed normally. After 33-day administration, mice were starved overnight and injected as described above, after 0.5-1 h mice in the groups A, B, C and D were given brominated oil to produce the liver injury models by oxidation. After 24 h, mice were sacrificed and we took the liver tissues to measure MDA, SOD and GSH-Px. In the experiment process, we recorded the body weight of mice every day and observed the spirit, diet and activity of mice.Results The content of MDA in the liver tissues of the experimental groups 1, 2, 3 and positive control group was lower than that of the blank control group, and the MDA content in the experimental groups 1, 2 and 3 was decreased gradually (allP<0.05). The inhibition rates of lipid peroxidation in the experimental groups 1, 2 and 3 were increased gradually and they were all lower than that of the positive control group (allP<0.05). The contents of MDA in serum and liver tissues of groups A, B and C were lower than those in the groups D and E, and the activity of SOD and GSH-Px in serum and liver tissues was higher than that of groups D and E. The contents of MDA in the groups A, B and C were reduced, while the activity of SOD and GSH-Px was increased gradually (allP<0.05). During the experiment, the mice did not appear weight loss, mental malaise or even death.Conclusions SFP could repair the oxidative liver injury of rats in vitro and prevent liver injury in mice, which is in a dose-dependent manner. The effect of SFP on liver injury may be related to reducing the formation of peroxidation products and improving antioxidant enzyme activity.

silkworm cocoon; fibroin polypeptides; oxidative liver injury; malondialdehyde; superoxide dismutase; glutathione peroxidase

科技部十二五“重大新藥創制”科技重大專項課題(2013ZX09303001)。

王美颯(1992-)，女，碩士研究生，主要研究方向為腫瘤臨床藥理學。E-mail： sasatjmu@163.com

閻昭(1973-)，男，主任藥師，主要研究方向為腫瘤臨床藥理學。E-mail： yanzhaopaper@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.007

R575

A

1002-266X(2017)03-0025-04

2016-07-27)