SENP1基因沉默的人Ⅱ型肺泡上皮細胞系構建

趙許，董文斌，雷小平，李清平，康蘭，趙帥，張嬋

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

SENP1基因沉默的人Ⅱ型肺泡上皮細胞系構建

趙許，董文斌，雷小平，李清平，康蘭，趙帥，張嬋

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

目的 構建穩定沉默SUMO特異性蛋白酶1(SENP1)基因的人Ⅱ型肺泡上皮細胞系HEPApiC。方法 構建沉默SENP1基因的LV3-SENP1-RNAi慢病毒載體。將HEPApiC細胞分為實驗組、對照組、空載組，實驗組感染LV3-SENP1-RNAi，空載組感染空載體，對照組不做特殊處理；感染72 h后觀察綠色熒光強度，采用qRT-PCR檢測HEPApiC細胞中的SENP1 mRNA，采用Western blotting法檢測SENP1蛋白。結果 經酶切鑒定及測序分析，成功構建LV3-SENP1-RNAi慢病毒載體質粒，包裝后得到高滴度的病毒顆粒。感染LV3-SENP1-RNAi的HEPApiC細胞中GFP表達隨時間延長逐漸增強，說明LV3-SENP1-RNAi成功感染HEPApiC細胞。實驗組、對照組、空載組細胞中SENP1 mRNA相對表達量分別為0.026、0.050、0.057，SENP1蛋白相對表達量分別為0.161±0.015、0.781±0.046、0.811±0.008；實驗組SENP1 mRNA及蛋白相對表達量降低，與對照組及空載組相比，P均<0.05。結論 成功構建了穩定沉默SENP1基因的HEPApiC細胞系。

小泛素相關修飾蛋白質類；人Ⅱ型肺泡上皮細胞；基因沉默；RNA干擾

隨著新生兒復蘇技術的提高，早產兒存活率也顯著上升，這與呼吸機的使用有很大關系。研究[1]發現，氧化應激反應是新生兒高氧肺損傷的重要發病機制之一，而呼吸機等新型醫療技術的應用增加了新生兒尤其是早產兒氧暴露的風險。高氧使患兒體內活性氧簇(ROS)生成增多，SUMO特異性蛋白酶1(SENP1)被激活，沉默接合型信息調節因子2同源蛋白1(SIRT1)的734位賴氨酸去SUMO化，減少SIRT1去乙酰化，激活細胞凋亡蛋白p53，進而誘導細胞凋亡[2]；而SIRT1可降低ROS水平，促進p53去乙酰化，抑制細胞凋亡[3]。因此推測SENP1可能通過SIRT1調節機體ROS水平，參與高氧肺損傷的發病過程。為進一步研究SENP1的功能及其在高氧肺損傷氧化應激反應中的作用機制，我們構建了穩定沉默SENP1基因的人Ⅱ型肺泡上皮細胞系HEPApiC，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與主要材料 HEPApiC細胞由西南醫科大學附屬醫院中心實驗室保存，HEK293T細胞由上海中科院細胞庫提供，HEPApiC細胞及HEK293T細胞培養于配制好的培養液中，在37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下培養。DMEM高糖培養基，胎牛血清；引物，DEPC，RT試劑，熒光定量PCR試劑，Sybr green Ⅰ，ECL增強化學發光檢測試劑盒，PrimeSTARTMHS DNA聚合酶，膠回收試劑盒，質粒小量抽提試劑盒，DNase Ⅰ(RNase-free)，Ex TaqTMR-PCR ver.2.1，AMV Reverase Transcriptase，BamH Ⅰ，NOtI EcoRI，T4 DNA ligase buffer，NucleoBond Xtra Midi Plus；制備感受態試劑盒，SENP1一抗(兔來源)，內參GAPDH一抗(兔來源)，羊抗兔IgG二抗。

1.2 LV3-SENP1-RNAi的構建及包裝 在GenBank查得SENP1(NM_29843)序列，依據RNA干擾(RNAi)原則設計三條引物，即ATF3-Mus-356、ATF3-Mus-546、ATF3-Mus-736，根據沉默效果選取ATF3-Mus-356作為靶序列并擴增，經EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切得到線性LV3，經純化、T4 DNA連接酶定向連接，將得到的表達載體轉化感受態細胞，PCR法及酶切法鑒定陽性克隆，對其進行測序和序列比對分析以驗證LV3-SENP1-RNAi的構建情況。利用質粒系統(LV3，PG-p1-VSVG，PG-P2-REV，PG-P3-RRE)對LV3-SENP 1-RNAi進行慢病毒包裝(其中LV3慢病毒穿梭質粒能表達GFP)，制備慢病毒顆粒。分別抽提上述四種質粒，共轉染常規培養的HEK293T細胞：轉染前1 d取狀態良好的對數期HEK293T細胞，胰蛋白酶消化，按2×106/皿接種，在37 ℃、50 mL/L CO2培養箱內培養；當細胞密度達60%～70%時，加入混合液(含質粒及磷酸鈣)，8 h后更換新鮮培養液，72 h后收集細胞上清液，4 000 r/min離心10 min后收集病毒上清液，0.45 μm濾器過濾，4 ℃、25 000 r/min離心2 h，而后以預冷的500 μL的DMEM重懸病毒沉淀，4 ℃溶解過夜。采用倍比稀釋法測定病毒滴度。

1.3 LV3-SENP1-RNAi感染HEPApiC細胞 取生長狀況良好的HEPApiC細胞，胰蛋白酶消化吹打成單細胞懸液，以(3～5)×104/孔的密度接種于24孔培養板，每孔加入100 μL培養基，培養24 h。鋪板時細胞融合率約50%，待融合率達70%且細胞狀態良好時開始后續試驗。將HEPApiC細胞分為兩組，實驗組按30個感染復數(MOI)/孔感染重組慢病毒顆粒，空載組按20 MOI/孔感染空載體。24 h后更換培養液繼續培養。96 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP熒光，計算感染效率。

1.4 SENP1基因沉默的HEPApiC細胞的構建及驗證 將HEPApiC細胞分為實驗組、對照組、空載組。實驗組及空載組依照“1.3”方法進行感染，對照組為未感染細胞。三組細胞均置于37 ℃、 50 mL/L CO2飽和濕度培養箱中進行培養，24 h后更換培養液。

1.4.1 SENP1 mRNA檢測 采用qRT-PCR法。按照說明書方法，感染72 h后提取細胞總mRNA，通過反轉錄反應體系生成cDNA，經過SYBR green Ⅰ熒光染料反應著色后用PCR儀進行檢測。SENP1基因上游引物序列為5′-CCAGCATTTTAACTAACCAGGAAC-3′，下游引物序列為5′-GCTAAGTTATCTGGCTGATGTGG-3′；GAPDH上游引物序列為5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物序列為5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。PCR擴增條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環35次，72 ℃檢測信號。檢測完畢得出Ct值，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

1.4.2 SENP1蛋白檢測 采用Western blotting法。感染72 h后收集三組細胞，提取總蛋白，稀釋方法同BSA標準品溶液，在酶標儀562 nm波長處測定吸光度值，依據BSA標準溶液吸光度值減Blank值的平均值繪制標準曲線，將各樣品溶液的吸光度值減Blank值的平均值帶入標準曲線，計算樣品中的蛋白濃度。蛋白上樣，經聚丙烯氨酰胺凝膠電泳，SDS-PAGE分離蛋白質，封閉液封閉，一抗孵育，二抗孵育，洗滌，曝光后分析目的條帶的灰度值，以經內參校正后的灰度值表示目的蛋白的相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LV3-SENP1-RNAi的構建及鑒定情況 慢病毒表達載體的酶切鑒定結果與預期相符，說明目的基因成功插入載體，測序結果正確(圖1)，LV3-SENP1-RNAi慢病毒表達載體構建成功。顯微鏡下見轉染慢病毒載體后的HEK293T細胞發出綠色熒光。經逐孔稀釋滴度測定法測定LV3-SENP1-RNAi病毒滴度為9×108TU/mL，LV3-GFP病毒滴度為3×108TU/mL。

圖1 重組質粒測序結果

2.2 LV3-SENP1-RNAi感染HEPApiC細胞情況 觀察HEPApiC細胞中GFP表達情況(見圖2)，發現感染LV3-SENP1-RNAi的細胞中GFP表達隨時間延長逐漸增強，96 h后熒光達到最強，說明LV3-SENP1-RNAi成功感染HEPApiC細胞。

注：A、B分別為感染空載體細胞的可見光、熒光圖像，C、D分別為感染LV3-SENP1-RNAi細胞的可見光、熒光圖像。

圖2 感染LV3-SENP1-RNAi的HEPApiC細胞中GFP表達情況

2.3 SENP1基因沉默HEPApiC細胞的構建及驗證情況 實驗組、對照組、空載組細胞中SENP1 mRNA相對表達量分別為0.026、0.050、0.057，SENP1蛋白相對表達量分別為0.161±0.015、0.781±0.046、0.811±0.008；實驗組SENP1 mRNA及蛋白相對表達量降低，與對照組及空載組相比，P均<0.05，表明感染LV3-SENP1-RNAi的HEPApiC細胞SENP1 mRNA及蛋白敲減成功，建立了穩定沉默SENP1基因的HEPApiC細胞系。

3 討論

氧化應激是細胞發生損傷、凋亡最常見的原因之一。當機體遭受各種有害刺激時，體內ROS產生過多或過快均會影響機體內氧化系統和抗氧化系統的平衡，當氧化系統占據主導地位時，極易發生組織損傷。目前，吸入高體積分數氧(高氧)是新生兒尤其是早產兒救治的重要手段，但高氧會誘導機體產生大量ROS。早產兒發育不成熟，對ROS的清除能力不足，高氧吸入治療早期即有可能發生急性肺損傷，一旦治療不及時或不當，將會大大增加支氣管、肺發育不良的發生率[4，5]。沉默接合型信息調節因子2同源蛋白1(SIRT1)是一類高度保守的依賴煙堿腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第3類組蛋白去乙酰化酶[6]，能介導細胞分化、凋亡、衰老，影響信號轉導、氧化應激、轉錄調節等重要生理過程，且在定位于細胞核才能發揮相應作用[7，8]。前期研究[9～11]顯示SIRT1參與了早產兒高氧誘導的氧化應激反應，了解SIRT1的功能及其上下游基因在氧化應激中發揮的作用十分必要。SENP1作為SIRT1的特異性去SUMO化酶，能通過對SIRT1的去SUMO修飾影響其在細胞核內外的分布，從而影響SIRT1的功能及其對下游基因的調控。因此我們認為，如果能夠在氧化應激發生早期下調SENP1表達，有望抑制其對SIRT1的去SUMO化作用，抑制p53的活性，減少細胞凋亡。

研究發現，蛋白質的翻譯后修飾(靶蛋白上特定氨基酸磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化等)是蛋白質發揮生物學功能的重要調節機制之一[12]。SUMO修飾是其中非常重要的一種，主要通過與靶蛋白共價連接發揮相應的修飾作用[13]。SENPs家族在SUMO化修飾與去SUMO化修飾之間發揮杠桿作用[14]。作為SENPs家族重要成員之一，SENP1同樣具有這種作用。SENP1可水解SUMO蛋白暴露其C端甘氨酸殘基，為SUMO與底物蛋白賴氨酸結合位點結合并修飾靶蛋白提供基礎；也可切斷SUMO與底物蛋白間的異肽鍵，實現去SUMO化過程[13]。目前學者們無法肯定SENP1是通過何種機制影響SIRT1的分布與功能，干擾SENP1基因表達能為二者間關系的研究提供參考。現已發現，在高氧條件下，SENP1蛋白表達減少，SIRT1表達也發生相應改變，說明二者之間可能存在聯系，并且均與氧化應激有關。

我們借助RNAi技術制備了三條SIRT1基因的干擾引物，選取ATF3-Mus-356作為靶序列并擴增。RNAi主要通過將外源性或內源性雙鏈RNA導入細胞，特異性降解與該段RNA同源的mRNA，繼而降低靶蛋白表達[15]。研究發現，相比致癌病毒，慢病毒雖然具有更復雜的復制周期、含有更復雜的基因組，但它們能感染非分裂細胞和分化末端的細胞。本研究成功構建LV3-SENP1-RNAi慢病毒載體質粒，將包裝好的病毒顆粒成功感染HEPApiC細胞，在熒光顯微鏡下，能通過載體上攜帶的GFP表達情況評價感染效率。本研究結果顯示，感染LV3-SENP1-RNAi的HEPApiC細胞中GFP表達隨時間延長逐漸增強，說明LV3-SENP1-RNAi成功感染HEPApiC細胞。進一步通過qRT-PCR與Western blotting檢測驗證顯示，實驗組SENP1 mRNA及蛋白相對表達量低于對照組及空載組，說明穩定沉默SENP1基因的HEPApiC細胞系構建成功。上述結果為進一步研究SENP1基因在新生兒高氧肺損傷發生中的具體作用機制奠定了實驗基礎。

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摘自《中國學術期刊(光盤版)檢索與評價數據規范》(修訂版CAJ-CD B/T 1-2006)

Establishment of HEPApiCs cell line stably silencing SENP1

ZHAOXu,DONGWenbin,LEIXiaoping,LIQingping,KANGLan,ZHAOShuai,ZHANGChan

(TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To establish human type II alveolar epithelial cells (HEPApiC) that can stably silence SUMO specific protease 1 (SENP 1) . Methods We constructed the LV3-SENP1-RNAi lentiviral vector silencing SENP1 gene.HEPApiC cells were divided into the experimental group, control group and empty vector group. The experimental group was infected with LV3-SENP1-RNAi, the empty vector group with empty vector and the control group was not treated. After 72-hour infection, the green fluorescence intensity was observed, the SENP1 mRNA in HEPApiC cells was detected by qRT-PCR, and SENP1 protein was detected by Western blotting.Results After restriction enzyme digestion and sequencing, the LV3-SENP 1-RNAi lentiviral vector plasmid was successfully constructed and we got a virion with a high titer. The expression of GFP in HEPApiC cells infected with LV3-SENP1-RNAi was gradually increased with time, indicating that LV3-SENP1-RNAi successfully infected HEPApiC cells. The relative expression of SENP1 mRNA in the experimental group, the control group and the empty vector group was 0.026, 0.050, and 0.057; and the relative expression of SENP1 protein was 0.161±0.015, 0.781±0.046 and 0.811±0.008, respectively. The expression of SENP1 mRNA and protein in the experimental group was lower than that in the control group and empty vector group, allP<0.05.Conclusion HEPApiCs cell line stably silencing SENP1 is successfully established.

small ubiquitin-related modifier proteins; human typeⅡalveolar epithelial cells; gene silencing; RNA interference

國家自然科學基金資助項目(81571480)；四川省科技廳科研項目(2014NZ0014)；瀘州市政府-瀘州醫學院聯合專項資金資助項目(2013LZLY-J08)。

趙許(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向為新生兒疾病。E-mail: linda1990xu@sina.com

董文斌(1967-)，男，教授，碩士生導師，主要研究方向為新生兒疾病。E-mail: dongwenbin2000@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.005

R722.19

A

1002-266X(2017)03-0016-04

2016-06-30)

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