米非司酮對孕激素受體M陽性子宮肌瘤細胞增殖、凋亡的影響

封全靈，熊禎禎，王智霆，張倩雯，劉弘揚，胡興韶，倪凌佩

(鄭州大學第三附屬醫院，鄭州450052)

米非司酮對孕激素受體M陽性子宮肌瘤細胞增殖、凋亡的影響

封全靈，熊禎禎，王智霆，張倩雯，劉弘揚，胡興韶，倪凌佩

(鄭州大學第三附屬醫院，鄭州450052)

目的 觀察米非司酮對孕激素受體M(PR-M)陽性子宮肌瘤細胞增殖、凋亡的影響。方法 收集因子宮肌瘤行全子宮切除術患者的子宮肌瘤標本，原代培養子宮肌瘤細胞成功后，采用Western blotting法篩選出PR-M陽性細胞(陽性組)和PR-M陰性細胞(陰性組)。取對數生長期的兩組細胞，分別加入0、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L的米非司酮，培養48 h后采用MTT法觀察細胞增殖抑制情況，采用流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。結果 米非司酮作用24 h后子宮肌瘤細胞生長明顯減慢，細胞開始皺縮，48 h后細胞開始碎解。隨米非司酮濃度增加，兩組細胞增殖抑制率和凋亡率均逐漸增加(P均<0.05)。當米非司酮濃度>1×10-6mol/L時，陽性組細胞增殖抑制率和凋亡率低于陰性組(P均<0.05)。結論 米非司酮用藥后PR-M陽性的子宮肌瘤細胞增殖受到抑制、凋亡增多，但與PR-M陰性細胞相比，增殖、凋亡變化程度較小。

米非司酮；孕激素受體M；子宮肌瘤細胞；細胞增殖；細胞凋亡

孕激素受體M(PR-M)是2003年發現的定位于細胞核外線粒體的孕激素受體[1]。研究[2，3]發現孕激素可誘導PR-M使線粒體膜電位增加，抑制乳腺癌細胞、原代及永生化子宮平滑肌細胞的凋亡。我們前期研究[4]發現PR-M、孕激素受體A(PR-A)和孕激素受體B(PR-B)在子宮肌瘤組織中的表達均顯著高于瘤旁正常子宮平滑肌組織，提示孕激素可能通過孕激素受體促進子宮肌瘤生長，這種作用可被孕激素受體拮抗劑(如米非司酮)阻斷。本研究在上述研究基礎上，培養原代子宮肌瘤細胞并篩選PR-M陽性細胞，觀察米非司酮對PR-M陽性子宮肌瘤細胞增殖、凋亡的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 隨機選取2015 年9月～2016年6月在我院因子宮肌瘤行腹腔鏡下全子宮切除術或腹式肌瘤挖除術的患者10例，年齡33～50歲，均無其他性激素相關合并癥，術前至少6個月內未服用類固醇激素。標本收集均經患者知情同意。術中無菌條件下取體積約1 cm3的肌瘤組織2～4塊，立即置于4 ℃含雙抗的DMEM培養基中。米非司酮，DMEM，DMEM-F12培養基，胎牛血清，四甲基偶氮唑藍(MTT)，青、鏈霉素，胰蛋白酶-EDTA，PBS，Ⅰ型膠原酶，SP試劑盒，DAP染色試劑盒。

1.2 子宮肌瘤細胞的分離培養及鑒定 根據文獻[5，6]方法并加以改良。將子宮肌瘤組織塊放入含雙抗PBS液的無菌培養皿中浸泡3～5 min后漂洗3次，剪碎組織，加入組織體積3～5倍的Ⅰ型膠原酶(濃度0.2%)，37 ℃水浴消化2～3 h，加入完全培養基終止消化，用200目不銹鋼細胞篩過濾收集濾液，1 000 r/min離心10 min后棄上清，加入10%濃度的完全培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中孵育培養。培養24 h后待細胞貼壁進行第1次換液，以后每2～3 d換液1次，待細胞融合達80%時用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態：密集處多呈旋渦狀生長，并出現層疊排列及典型的“峰-谷”樣現象。待第3代細胞長滿后制作單細胞懸液，接種于帶6孔板的蓋玻片上，待細胞融合度在70%～80%時吸棄培養基，采用免疫組化染色，鏡下觀察鑒定子宮肌瘤細胞(見圖1)。

圖1 倒置相差顯微鏡下子宮肌瘤細胞形態(免疫組化染色，400×)

1.3 PR-M陽性子宮肌瘤細胞的篩選 采用Western blotting法。取第3代子宮肌瘤細胞，接種于6孔板中，培養細胞融合至80%～90%時，提取細胞總蛋白，取25 μg/孔進行10% SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白質電轉移至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST漂洗3次，加入1∶800稀釋的PR兔源多克隆抗體，4 ℃冰箱過夜，加入1∶4 000稀釋的紅色熒光標記的羊抗兔IgG，室溫反應2 h，TBST漂洗，采用Odyssey雙色紅外熒光成像系統掃描并分析蛋白條帶灰度值，從而篩選出PR-M陽性細胞(陽性組，反表達PR-M、不表達PR-A/B)和PR-M陰性細胞(陰性組，無PR-M表達、有PR-A/B表達)。

1.4 米非司酮用藥后子宮肌瘤細胞增殖情況觀察 收集對數生長期的陽性組和陰性組細胞，以1×104/孔接種于96孔板，分別加入0、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L的米非司酮，培養48 h后倒置顯微鏡下動態觀察細胞生長情況。酶標儀在450 nm波長測定各孔光密度(OD)值，重復3次，取均值。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.5 米非司酮用藥后子宮肌瘤細胞凋亡情況觀察 收集對數生長期的陽性組和陰性組細胞，以2.5×105/mL接種于6孔板，培養24 h；待細胞貼壁后，分別加入終濃度為0、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L的米非司酮，每組設3個重復孔。培養48 h后收集細胞，加入適量的PBS緩沖液，1 500 r/min離心5 min，棄上清，此步驟反復2次。加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞，再加入5 μL的Annexin V混勻后，加入5 μL的PI，混勻；反應15 min后，于1 h內采用流式細胞儀觀察Annexin V/PI染色陽性細胞數，計算其占總細胞數百分比，即為細胞凋亡率。

2 結果

2.1 米非司酮用藥后子宮肌瘤細胞增殖變化 米非司酮用藥24 h后細胞生長明顯減慢，細胞開始皺縮，48 h后細胞開始碎解。且隨米非司酮濃度增加，兩組細胞增殖抑制率均逐漸增加(P均<0.05)。當米非司酮濃度>1×10-6mol/L時，陽性組細胞增殖抑制率低于陰性組(P均<0.05)。詳見表1。

2.2 米非司酮用藥后子宮肌瘤細胞凋亡變化 隨著非米司酮濃度增加，兩組細胞凋亡率均逐漸增高(P均<0.05)。當米非司酮濃度>1×10-6mol/L時，陽性組細胞凋亡率低于PR-M陰性組(P均<0.05)。詳見表1。

3 討論

體外培養的子宮肌瘤細胞是研究子宮肌瘤發病機制和治療藥物的理想材料，但由于子宮肌瘤并非惡性腫瘤，缺少無限增殖的特性，高純度且生長狀態穩定的肌瘤細胞的提取與培養是一個難題。本研究參考文獻[5，6]的方法，通過縮短標本送實驗室時間及消化前清洗處理時間，提高了細胞提取率和細胞純度，擴大了細胞數量，成功建立了子宮肌瘤體外細胞模型。

表1 不同濃度米非司酮用藥后兩組細胞增殖抑制率和凋亡率比較±s)

Ishikawa等[7]推斷子宮肌瘤體積的維持和增大受孕激素影響，孕激素可能通過增加細胞外基質量并延長細胞壽命而發揮作用。PR-M結構上較傳統孕激素受體PR-A、PR-B缺少氨基末端的A/B結構域、核定位信號區和DNA結構域，僅有激素結合結構域和鉸鏈區；另外，PR-M氨基末端存在由16個氨基酸構成的線粒體定位序列，這可能與其特有的線粒體定位功能相關[8]。有研究[9]表明，孕激素可以劑量依賴的形式誘導原代培養和永生化子宮平滑肌細胞線粒體膜電位增加，且這種反應能被孕激素受體拮抗劑所抑制。PR-M在孕激素誘導下能控制細胞呼吸，增加細胞能量的產生，從而供細胞存活和增殖[10]。有學者[11]提出孕激素受體能直接激活信號通路引起子宮肌瘤細胞增殖。我們前期研究[12]發現PR-M在子宮肌瘤中的表達明顯高于瘤旁組織，提示孕激素可能通過PR-M增強子宮肌瘤細胞的能量代謝，導致細胞異常增殖[13]。PR-M陽性子宮肌瘤細胞異常增殖和凋亡抑制機制可能與激活Fas/FasL通路有關，同時伴隨Caspase-3、Caspase-7活性下調。米非司酮是炔諾酮11-β-二甲基-氨基-苯基衍生物，可調節孕激素受體表達，阻滯子宮肌瘤細胞于G0/G1期，從而抑制細胞增殖、促進其凋亡[14]。

本研究在原代培養的子宮平滑肌瘤細胞中發現了PR-M，分別篩選出PR-M陽性和陰性的子宮肌瘤細胞，加入不同濃度的米非司酮作用，觀察細胞增殖和凋亡情況。本研究結果顯示，米非司酮作用24 h后細胞生長明顯減慢，細胞開始皺縮，48 h后細胞開始碎解；隨米非司酮濃度增加，兩組細胞增殖抑制率和凋亡率均逐漸增加；當米非司酮濃度>1×10-6mol/L時，陽性組細胞增殖抑制率和凋亡率均小于陰性組。由此可見，米非司酮對PR-M陽性的子宮肌瘤細胞具有增殖抑制和促凋亡作用，作用呈劑量依賴性，作用強度較PR-M陰性細胞弱。我們推測孕激素可能通過PR-M抑制子宮肌瘤細胞凋亡、促進子宮肌瘤發生發展，這種作用可被孕激素受體拮抗劑阻斷,具體機制和相關信號通路仍待進一步探索發現。

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Effects of mifepristone on proliferation and apoptosis of progesterone

receptor M positive uterine leiomyoma cellsFENGQuanling,XIONGZhenzhen,WANGZhiting,ZHANGQianwen,LIUHongyang,HUXingshao,NILingpei

(TheThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Objective To observe the effect of mifepristone on proliferation and apoptosis of progesterone receptor M (PR-M) positive uterine leiomyoma cells. Methods The specimen were collected from patients undergoing hysterectomy because of uterine fibroids. After the uterine leiomyoma cells were successful primarily cultured, the PR-M positive cells (positive group) and PR-M negative cells (negative group) were screened by Western blotting. Cells in the logarithmic growth phase of two groups were added with 0.1, 1×10-6, 1×10-5and 1×10-4mol/L mifepristone, respectively. After 48-hour culture, the inhibition of cell proliferation was observed by MTT, and the apoptosis was observed by flow cytometry.Results The growth of uterine leiomyoma cells slowed down and began to shrink after treatment of mifepristone for 24 h, and began to break at 48 h. With the increasing concentrations of mifepristone, the cell proliferation inhibition rate and apoptosis rate were increased gradually in the two groups (allP<0.05). When the concentration of mifepristone >1×10-6mol/L, the proliferation inhibition rate and the apoptosis rate of cells in the positive group was lower than that of the negative group (allP<0.05).Conclusion The proliferation is inhibited and the apoptosis increased in the PR-M positive uterine leiomyoma cells after mifepristone intervention, but the degree changed less as compared with PR-M negative cells.

mifepristone; progesterone receptor M; uterine leiomyoma cells; cell proliferation; apoptosis

河南省高等學校重點科研項目計劃(16A320047)。

封全靈(1965-)，女，博士，教授，主任醫師，主要研究方向為婦科腫瘤及內分泌基礎與臨床。E-mail: 614992855@qq.com

封全靈

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.004

R711.7

A

1002-266X(2017)03-0013-03

2016-09-19)